Đặc điểm và chuẩn bị phết vi khuẩn

các phết vi khuẩn là một phần mở rộng dưới dạng một màng mỏng của huyền phù vi sinh vật vi khuẩn được thực hiện trên một tấm thủy tinh trong suốt hoặc các phiến kính, để quan sát dưới kính hiển vi quang học.

Việc mở rộng dưới dạng phim được thực hiện để phân tách các vi sinh vật càng nhiều càng tốt, bởi vì nếu chúng được nhóm lại, việc quan sát không rõ ràng.

Trong nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn chuẩn bị phết, cố định và tạo màu được sử dụng để phân tích chúng tốt hơn. Do kích thước nhỏ của vi sinh vật, việc sử dụng kính hiển vi quang học là cần thiết cho việc quan sát của nó.

Kính hiển vi quang học là dụng cụ không thể thiếu để quan sát vết bẩn. Chúng sử dụng ống kính quang học và ánh sáng cho phép hiển thị các mẫu với kích thước tăng lớn.

Nhìn chung, các tế bào sống không có cấu trúc hầu hết có màu, nhìn qua kính hiển vi quang học, chúng là các mẫu không màu, trong suốt và hiển thị rất ít độ tương phản bên trong và với môi trường xung quanh.

Việc quan sát bằng kính hiển vi trường ánh sáng đơn giản, không sử dụng các kỹ thuật nhuộm phụ trợ, rất hạn chế và chỉ được sử dụng trong một số trường hợp, như trong quan sát sự di chuyển của vi sinh vật.

Để quan sát vi sinh vật một cách tối ưu, phải đạt được sự cân bằng giữa độ tương phản và độ phân giải. Các chi tiết của các tế bào không thể được quan sát dưới kính hiển vi, ngay cả ở độ phân giải cao; việc sử dụng thuốc nhuộm được yêu cầu thông qua các kỹ thuật nhuộm màu, cung cấp độ tương phản để quan sát.

Chỉ số

• 1 Đặc điểm của phết vi khuẩn chất lượng tốt
  • 1.1 Độ tương phản tuyệt vời
  • 1.2 Sửa chữa tốt
  • 1.3 nhuộm tốt
• Chuẩn bị 2
  • 2.1 A. Frotis
  • 2.2 B. Cố định
  • 2.3 C. nhuộm đơn giản
  • 2.4 D. Bảo quản dứt khoát vết bẩn
• 3 tài liệu tham khảo

Đặc điểm của phết vi khuẩn chất lượng tốt

Độ tương phản tuyệt vời

Để đạt được độ tương phản tuyệt vời, có các kính hiển vi tinh vi được gọi là kính hiển vi tương phản pha, nhiễu vi phân và kính hiển vi trường tối. Loại kính hiển vi này được sử dụng để quan sát các cấu trúc vi khuẩn như vỏ bọc và sợi tơ, trong số những loại khác.

Nhuộm là một kỹ thuật đơn giản để tăng độ tương phản đạt được với kính hiển vi trường rõ ràng. Trong kỹ thuật này, các thuốc nhuộm khác nhau có thể được sử dụng để cải thiện đáng kể sự quan sát dưới kính hiển vi.

Các vết bẩn được thực hiện trực tiếp trên vết bẩn hoặc phần mở rộng của huyền phù của vi sinh vật trên các phiến kính, được sấy khô và cố định trước đó.

Sửa chữa tốt

Cố định là một kỹ thuật được sử dụng để bảo tồn cấu trúc tế bào; gây ra sự bất hoạt của các vi sinh vật và sự bám dính vào kính của slide. Có các phương pháp điều trị cố định khác nhau: cố định nhiệt và cố định hóa học.

Cố định nhiệt

Đây là phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong quan sát phết vi khuẩn. Kỹ thuật này bao gồm việc truyền huyền phù vi khuẩn của vết bẩn bằng ngọn lửa của bật lửa. Kỹ thuật này có thể bảo tồn hình thái bên ngoài của vi khuẩn, nhưng phá hủy cấu trúc bên trong của chúng.

Cố định hóa học

Cố định hóa học sử dụng các hóa chất trong bảo quản, chẳng hạn như formaldehyd hoặc formaldehyd, ethanol và axit axetic, trong số những thứ khác. Ưu điểm của việc sử dụng các tác nhân cố định hóa học là việc bảo tồn cấu trúc tế bào bên trong của vi sinh vật đã đạt được.

Nhuộm tốt

Các quy trình phổ biến nhất để nhuộm một vết bẩn khô và cố định trước đó là nhuộm màu dương tính hoặc đơn giản, nhuộm màu khác biệt và nhuộm màu âm tính. Ngoài ra còn có các kỹ thuật đặc biệt để nhuộm cấu trúc tế bào đặc biệt (viên nang, bào tử, Flagella).

Nhuộm tích cực hoặc nhuộm đơn giản

Nhuộm tích cực hoặc đơn giản là kỹ thuật nhuộm vết bẩn được sử dụng nhiều nhất. Sử dụng thuốc nhuộm có khả năng liên kết với các cấu trúc vi sinh vật nhất định, cho phép chúng được quan sát dưới kính hiển vi.

Những thuốc nhuộm này có các nhóm sắc tố (phần màu) trong cấu trúc hóa học của chúng, với các liên kết đôi xen kẽ và các liên kết đơn giản (liên hợp). Các liên kết này có thể lần lượt thiết lập liên kết ion hoặc cộng hóa trị với một số cấu trúc tế bào.

Các thuốc nhuộm được sử dụng trong nhuộm màu tích cực hoặc đơn giản chủ yếu là các dẫn xuất hóa học của anilin (muối hữu cơ màu).

Mặt khác, trong số các thuốc nhuộm, chúng ta có thể tìm thấy một số có pH cơ bản và một số khác có pH axit.

Chất màu cơ bản

Trong thuốc nhuộm cơ bản, nhóm chromophore có điện tích dương. Phần lớn các vi sinh vật prokaryote có pH bên trong trung tính, và bề mặt tế bào của chúng được tích điện âm. Thông qua tương tác tĩnh điện này, chromophore liên kết với tế bào và nhuộm nó.

Ví dụ về thuốc nhuộm cơ bản là xanh methylen, tinh thể tím, xanh malachite, fuscin cơ bản, safranin, trong số những loại khác.

Thuốc nhuộm axit

Trong thuốc nhuộm axit, nhóm chromophore có điện tích âm. Chúng được sử dụng để nhuộm protein với các nhóm amino tích điện dương. Ví dụ về thuốc nhuộm axit là axit fuscin, hoa hồng Bengal, đỏ Congo và eosin.

Nhuộm màu khác biệt

Kỹ thuật nhuộm vi sai bao gồm áp dụng hai thuốc nhuộm có màu hoặc cường độ khác nhau, để phân biệt các vi sinh vật khác nhau dưới kính hiển vi. Nhuộm gram và nhuộm kháng axit-cồn là những vết khác biệt được sử dụng nhiều nhất trong vi khuẩn học.

Nhuộm gram được sử dụng như một thử nghiệm sơ bộ để biết hình dạng, kích thước, nhóm tế bào, ngoài loại thành tế bào. Thông qua xét nghiệm nhuộm Gram, vi khuẩn có thành tế bào được phân loại là vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm.

Nhuộm màu

Trong kỹ thuật này, thuốc nhuộm hóa học được sử dụng không xâm nhập vào bên trong tế bào, nhưng chúng làm môi trường trong đó các vi sinh vật xuất hiện dưới dạng nền đen.

Trong kỹ thuật nhuộm màu tiêu cực, vết bẩn được tạo ra bằng một giọt huyền phù của mực Trung Quốc hoặc nigrosine, sau khi cho phép sấy khô ở nhiệt độ phòng tạo thành một màng mờ cho ánh sáng đi qua. Theo cách này, các vi sinh vật được quan sát dưới dạng các hình thức sáng trên nền tối.

Chuẩn bị

A. Xì trum

1.- Rửa các phiến rất tốt, lau khô bằng giấy thấm và dán nhãn. Nhãn phải ghi rõ nội dung của việc chuẩn bị, ngày và tên của người đã xử lý nó.

2.- Bật lửa và khử trùng vòng tiêm trong ngọn lửa cho đến khi nóng đỏ.

3.- Để tay cầm nguội.

4.- Lấy ống nuôi cấy vi khuẩn, tháo nắp và nhanh chóng vượt qua miệng ống gần ngọn lửa (ngọn lửa).

5.- Giới thiệu vòng cấy trong ống chứa môi trường nuôi cấy vi khuẩn và lấy mẫu.

6.- Nếu nuôi cấy trong môi trường lỏng, đặt mẫu được lấy bằng tay cầm ở giữa slide và trải cẩn thận trong một vòng tròn có đường kính khoảng 2 cm.

7.- Khử trùng lại vòng tiêm chủng.

8.- Cho phép làm khô vết bẩn trong không khí.

9.- Lặp lại các bước 3 đến 8 ba lần.

10.- Nếu nuôi cấy trong môi trường rắn, một giọt nước cất trước đó phải được đặt trên phiến kính. Điều này được thực hiện để trộn một mẫu nhỏ của mẫu nuôi cấy được xử lý bằng cách tiêm, theo chỉ dẫn của các bước từ 2 đến 5 (điều kiện của vô khuẩn).

11.- Kéo dài mẫu đã pha loãng với giọt nước trên phiến kính và lặp lại ba lần.

B. Cố định

1.- Thêm vào các vết bẩn khô - được sản xuất từ ​​các mẫu nuôi cấy trong môi trường lỏng-, hai giọt metanol hoặc ethanol tuyệt đối.

2.- Cho phép sấy khô trong không khí từ bật lửa.

3.- Nếu vết bẩn xuất phát từ môi trường nuôi cấy trong môi trường rắn, vết bẩn khô được cố định bằng nhiệt, truyền nhanh 2 đến 3 lần qua khu vực nóng nhất của ngọn lửa của bật lửa.

4.- Chạm vào phần dưới của vết bẩn bằng phần lưng của bàn tay trái (đối với người thuận tay phải, nếu không thì sử dụng tay phải) và kiểm tra xem nó có lạnh không.

C. nhuộm đơn giản

1.- Thêm 2 giọt thuốc nhuộm đã chọn vào vết bẩn và để nó hoạt động trong thời gian cần thiết trong các giao thức cụ thể của từng thuốc nhuộm (thường là từ 1 đến 5 phút).

2.- Một số thuốc nhuộm yêu cầu sử dụng nhiệt để kích hoạt, trong trường hợp đó cần phải rất cẩn thận khi làm nóng phiến trong ngọn lửa của bật lửa (thao tác bằng nhíp và tránh đun sôi). Quá nóng của vết bẩn có thể phá hủy các tế bào mà bạn muốn quan sát.

3.- Loại bỏ thuốc nhuộm dư thừa bằng cách rửa bằng nước cất từ ​​picette. Loại bỏ nước giặt bằng cách chạm nhẹ vào nắp trượt trên cạnh của nó, nghiêng trên bàn làm việc.

4.- Cho phép sấy không khí.

5.- Tùy thuộc vào loại quan sát, lớp phủ được sử dụng hay không trong giai đoạn này. Các lớp phủ bảo vệ và bảo quản vết bẩn. Nếu quan sát được thực hiện bằng cách ngâm trong dầu ở giai đoạn này, không có lớp phủ nào được sử dụng nhưng không thể bảo quản vết bẩn.

D. Bảo quản dứt khoát vết bẩn

1.- Nhúng vết bẩn liên tiếp vào từng dung dịch được chỉ ra dưới đây, trong tối thiểu 5 phút. Mục đích của những "phòng tắm" này là để cho vết bẩn mất nước hoàn toàn. Mỗi thuốc thử phải được ráo nước, trước khi giới thiệu vết bẩn trong bồn tắm tiếp theo.

Thứ tự của các phòng tắm khử nước như sau:

1. Ethanol 70%
2. Ethanol 95%
3. Acetone tinh khiết
4. Trộn acetone-xylol 1: 1
5. Xilol

Sau đó cho phép sấy không khí.

2.- Gắn lớp phủ, tốt nhất là 22 × 22 mm, sử dụng balsam của Canada hoặc các phương tiện lắp ráp khác.

Tài liệu tham khảo

1. Briggs, G. (1965). Các yếu tố nguyên nhân trong các tai nạn và nhiễm trùng trong phòng thí nghiệm vi sinh. Phòng thí nghiệm sinh học của quân đội Hoa Kỳ. Pháo đài Detrick.
2. Cappucino, J.G. và tiếng Wales, C.T. (2017). Vi sinh: Hướng dẫn thí nghiệm. Pearson.
3. Holt, J.G. Biên tập viên (1977). Hướng dẫn ngắn hơn về vi khuẩn xác định của Bergey. 8^thứ Baltimore: Công ty Williams và Wilkins.
4. Johnson, T.R. và trường hợp; C.L. (2018). Thí nghiệm trong phòng thí nghiệm vi sinh. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Chẩn đoán vi sinh. 14^thứ St. Louis, Hoa Kỳ: Elsiever, Inc.