Nền tảng thử nghiệm, chuẩn bị và sử dụng Voges-Proskauer



các Thử nghiệm Voges-Proskauer là một xét nghiệm sinh hóa được sử dụng để giúp xác định vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Đặc biệt là rất hữu ích để phân biệt các chủng Escherichia coli của Klebsiella và Enterobacter, trong số những người khác.

Thử nghiệm được thực hiện trong môi trường nuôi cấy lỏng gọi là methyl red-Voges Proskauer, được biết đến nhiều hơn bởi từ viết tắt RM / VP. Môi trường này bao gồm polypeptone đệm, glucose, dipotosphat kali và nước cất.

Môi trường RM / VP hiện tại là một sửa đổi của môi trường Clark và Lubs, ban đầu chứa nồng độ pepton và glucose thấp hơn. Do đó, ít ion hydro được tạo ra, cần thiết cho phản ứng Voges-Proskauer dương.

Thử nghiệm dựa trên khả năng của vi sinh vật sử dụng glucose thông qua con đường butylen glycol và tạo thành một sản phẩm cuối trung tính có tên là acetoin, với sự hiện diện của oxy và độ pH kiềm.

Trong môi trường RM / VP, ngoài việc có thể tiết lộ thử nghiệm Voges-Proskauer, thử nghiệm đỏ methyl cũng có thể được tiết lộ.

Chỉ số

  • 1 nền tảng
    • 1.1 Cơ sở của thử nghiệm Voges-Proskauer
    • 1.2 Cơ sở để phát triển bài kiểm tra và diễn giải
  • Chuẩn bị 2
    • 2.1 Trung bình RM / VP
    • 2.2 Voges Một thuốc thử
    • Thuốc thử 2.3 Voges B
  • 3 Quy trình thử nghiệm Voges-Proskauer
    • 3.1 Phát triển bài kiểm tra
  • 4 Sử dụng
  • 5 Kiểm soát chất lượng
  • 6 tài liệu tham khảo

Nền tảng

Cơ sở của thử nghiệm Voges-Proskauer

Các pluripepton có trong môi trường cung cấp các yêu cầu dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn. Về phần mình, glucose là hợp chất chính. Nhiều vi khuẩn có khả năng chuyển hóa glucose và tạo thành axit pyruvic.

Axit pyruvic là một điểm trung gian trong quá trình chuyển hóa glucose và từ đó mỗi vi sinh vật có thể đi theo những con đường khác nhau. Một số sẽ tạo thành axit hỗn hợp, chẳng hạn như axit lactic, axit axetic, axit formic và axit succinic, và một số khác sẽ tạo thành các sản phẩm trung tính như 2,3-butanediol.

Thử nghiệm Voges-Proskauer cho thấy khả năng của vi sinh vật tạo thành acetyl methyl carbinol (acetoin), một sản phẩm trung gian của 2,3-butanediol trong điều kiện hiếu khí.

Acetoin bị khử và tạo thành 2,3-butanediol, nhưng phản ứng này có thể đảo ngược, vì vậy nếu 2,3-butanediol bị oxy hóa, acetoin được hình thành. Do đó, oxy là điều cần thiết.

Dipotali phosphate là chất đệm làm ẩm hỗn hợp ở pH 6,9 ± 0,2..

Cơ sở cho sự phát triển của bài kiểm tra và diễn giải

Để chứng minh phản ứng, sự phát triển phải được thực hiện bằng cách sử dụng hai thuốc thử (thuốc thử Barrit), được gọi là Voges A và Voges B.

Voges A là dung dịch α-naphthol 5% và Voges B là chế phẩm kali hydroxit 40%. Nếu kali hydroxit không có sẵn, nó có thể được thay thế bằng 40% natri hydroxit.

Α-naphthol là chất xúc tác sẽ làm tăng cường độ màu của phản ứng, làm cho xét nghiệm nhạy hơn. Phải luôn luôn thêm α-naphthol trước, khuấy ống để môi trường tiếp xúc với oxy. Theo cách này, hiện tại acetoin bị oxy hóa thành diacetyl và 2,3-butanediol bị oxy hóa để tạo thành acetoin, chuyển nó sang diacetyl.

Đây là cách mà α-naphthol sẽ liên kết với diacetyl, do đó đã được liên kết với hạt nhân guanidine có trong axit amin arginine, sau này đến từ pluripeptonas.

Về phần mình, kali hoặc natri hydroxit chịu trách nhiệm hấp thụ CO2 và phản ứng với peptones. Phản ứng này gây ra sự hình thành màu hồng cá hồi, có thể thấy rõ sau khi lắc ống rất tốt.

Để quá trình tạo màu xảy ra tức thời, phải trộn đúng lượng diacetyl, peptone và α-naphthol. Nếu điều này không xảy ra, hãy để ống nghỉ 15 phút trước khi diễn giải.

Thông thường xét nghiệm dương tính sau 2 đến 5 phút, khi có thể quan sát thấy màu hồng yếu. Nếu để yên trong 30 phút đến 1 giờ, cường độ màu sẽ tối đa (đỏ đậm).

Một xét nghiệm âm tính sẽ rõ ràng khi nước dùng có màu vàng. Sau 1 giờ, nếu xét nghiệm âm tính, màu đồng có thể được hình thành do phản ứng của kali hydroxit trên α-naphthol.

Chuẩn bị

Trung bình RM / VP

Cân 17 g môi trường nuôi cấy khử nước và hòa tan trong một lít nước cất. Để yên trong 5 phút. Đun cho đến khi sôi cho tan hoàn toàn. Cho 3 đến 4 ml vào ống và khử trùng trong nồi hấp ở 121 ° C trong 15 phút.

Môi trường nuôi cấy mất nước là màu be và môi trường chuẩn bị là màu hổ phách nhạt.

Độ pH cuối cùng của môi trường là 6,9 ± 0,2.

Voges Một thuốc thử

Cân 5 g α-naphthol và hòa tan trong 50 ml rượu ethyl (tuyệt đối). Sau đó tiếp tục thêm rượu ethyl để tạo thành 100 ml.

Thuốc thử Voges B

Cân 40 g kali hydroxit và hòa tan trong 50 ml nước cất trong cốc thủy tinh. Nên đặt ly trong bể nước lạnh để kiểm soát nhiệt độ, vì tại thời điểm hòa tan, chế phẩm tăng mạnh.

Sau khi dung dịch nguội, nó được chuyển sang một quả bóng tốt nghiệp và mang đến 100 mL bằng nước cất.

Quy trình thử nghiệm Voges-Proskauer

Để thực hiện thử nghiệm Voges-Proskauer, nước dùng RM / VP được cấy vi sinh vật đang nghiên cứu, từ một nền văn hóa thuần túy từ 18 đến 24 giờ.

Cấy không nên quá đậm đặc. Nó được ủ ở 35-37 ° C trong 24 đến 48 giờ, mặc dù đôi khi việc ủ là cần thiết trong vài ngày. Cowan và Steel tin rằng 5 ngày là thời gian ủ tối thiểu cần thiết để phát hiện tất cả các loài Voges-Proskauer (VP) dương tính thuộc họ Enterobacteriaceae.

Phát triển bài kiểm tra

Tách một phần dịch 1 ml trong một ống và thực hiện quá trình phát triển như sau: đặt 12 giọt (0,6 mL) thuốc thử Voges Một thuốc thử và 4 giọt (0,2 mL) Voges B. Trộn vào khí dung trong 5 - 10 phút trước khi thực hiện. Tuy nhiên, nếu xét nghiệm vẫn âm tính, hãy để nó đứng và quan sát ống sau 30 phút đến 1 giờ.

Sự xuất hiện của màu đỏ hồng cho thấy phản ứng Voges-Proskauer là dương tính. Nếu môi trường giữ màu vàng, phản ứng âm tính.

Việc bổ sung các nhà phát triển theo thứ tự và số lượng được chỉ định là điều cần thiết để tránh tiêu cực sai.

Sử dụng

Thử nghiệm Voges-Proskauer rất hữu ích để phân biệt giữa các chủng E.coli đó là VP âm tính, của các chi Klebsiella, Enterobacter, Serratia, trong số những người khác, là VP dương tính.

Kiểm soát chất lượng

Các chủng đối chứng có thể được sử dụng để kiểm tra chất lượng của môi trường đã chuẩn bị. Escherichia coli ATCC 25922, Viêm phổi do Klebsiella ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium và Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Các kết quả dự kiến ​​là các phản ứng Voges-Proskauer dương chỉ dành cho K. pneumoniae và E. cloa. Phần còn lại cho phản ứng tiêu cực.

Tài liệu tham khảo

  1. Phòng thí nghiệm Britania. MR-VP Trung bình. 2015. Có sẵn tại: www.britanialab.com
  2. Phòng thí nghiệm Microkit M-Ident Voges Proskauer. 2014. Có sẵn: http://www.medioscultivo.com
  3. Mac Faddin J. (2003). Các xét nghiệm sinh hóa để xác định vi khuẩn có tầm quan trọng lâm sàng. Tái bản lần 3 Biên tập Panamericana. Thủ đô Argentina.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Chẩn đoán vi sinh của Bailey & Scott. 12 ed. Biên tập Panamericana S.A. Argentina.
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Chẩn đoán vi sinh. Tái bản lần thứ 5 Biên tập Panamericana S.A. Argentina.