Hạn chế chức năng enzyme, cơ chế hoạt động, loại và ví dụ



các enzyme hạn chế chúng là các endonuclease được sử dụng bởi một số vi khuẩn cổ và vi khuẩn để ức chế hoặc "hạn chế" sự lây lan của virus bên trong chúng. Chúng đặc biệt phổ biến ở vi khuẩn và là một phần của hệ thống phòng thủ chống lại DNA ngoại lai được gọi là hệ thống hạn chế / sửa đổi.

Các enzyme này xúc tác cho việc cắt DNA sợi đôi tại các vị trí cụ thể, có thể tái tạo và không sử dụng năng lượng bổ sung. Hầu hết yêu cầu sự hiện diện của các đồng yếu tố như magiê hoặc các cation hóa trị hai khác, mặc dù một số cũng yêu cầu ATP hoặc S-adenosyl methionine.

Các endonuclease hạn chế được phát hiện vào năm 1978 bởi Daniel Nathans, Arber Werner và Hamilton Smith, người đã nhận được giải thưởng Nobel về y học vì khám phá của họ. Tên của nó thường bắt nguồn từ sinh vật nơi chúng được quan sát lần đầu tiên.

Các enzyme như vậy được sử dụng rộng rãi trong việc phát triển các phương pháp nhân bản DNA và các chiến lược sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền khác. Đặc điểm của nó là nhận biết các trình tự cụ thể và khả năng cắt các trình tự gần với các vị trí nhận biết làm cho chúng trở thành công cụ mạnh mẽ trong thử nghiệm di truyền.

Các đoạn được tạo ra bởi các enzyme cắt giới hạn đã hoạt động trên một phân tử DNA cụ thể có thể được sử dụng để tạo lại "bản đồ" của phân tử ban đầu bằng cách sử dụng thông tin về các vị trí mà enzyme cắt DNA.

Một số enzyme hạn chế có thể có cùng vị trí nhận dạng trong DNA, nhưng chúng không nhất thiết phải cắt nó theo cùng một cách. Do đó, có những enzyme tạo ra các vết cắt để lại các đầu cùn và các enzyme cắt để lại các đầu kết dính, có các ứng dụng khác nhau trong sinh học phân tử.

Hiện tại có hàng trăm enzyme hạn chế thương mại khác nhau, được cung cấp bởi các nhà thương mại khác nhau; các enzyme này hoạt động như kéo phân tử "tùy chỉnh" cho các mục đích khác nhau.

Chỉ số

  • 1 chức năng
  • 2 Cơ chế hoạt động
  • 3 loại
    • 3.1 Enzim hạn chế loại I
    • 3.2 Enzim hạn chế loại II
    • 3.3 Enzim hạn chế loại III
    • 3,4 Enzim hạn chế loại IV
    • Enzim giới hạn 3.5 loại V
  • 4 ví dụ
  • 5 tài liệu tham khảo

Chức năng

Enzim hạn chế phục vụ chức năng đối nghịch của polymerase, vì chúng thủy phân hoặc phá vỡ liên kết este trong liên kết phosphodiester giữa các nucleotide liền kề trong chuỗi nucleotide.

Trong sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền, chúng là những công cụ được sử dụng rộng rãi để xây dựng các vectơ biểu hiện và nhân bản, cũng như để xác định các trình tự cụ thể. Chúng cũng hữu ích cho việc xây dựng bộ gen tái tổ hợp và có tiềm năng công nghệ sinh học lớn.

Những tiến bộ gần đây trong liệu pháp gen sử dụng các enzyme cắt giới hạn hiện nay để đưa một số gen nhất định vào các vec tơ là phương tiện để vận chuyển các gen đó đến các tế bào sống và có thể có khả năng đưa vào bộ gen của tế bào để thực hiện thay đổi vĩnh viễn.

Cơ chế hoạt động

Các enzyme hạn chế có thể xúc tác cho việc cắt DNA chuỗi kép, mặc dù một số có thể nhận ra các chuỗi DNA đơn và thậm chí RNA. Việc cắt xảy ra sau khi nhận ra các trình tự.

Cơ chế hoạt động bao gồm quá trình thủy phân liên kết phosphodiester giữa một nhóm phốt phát và deoxyribose trong xương sống của mỗi chuỗi DNA. Nhiều enzyme có thể cắt ở cùng một vị trí mà chúng nhận ra, trong khi các enzyme khác cắt từ 5 đến 9 cặp bazơ trước hoặc sau nó..

Thông thường các enzyme này cắt ở đầu 5 'của nhóm phốt phát, tạo ra các đoạn DNA với đầu 5' phosphoryl và đầu 3 'hydroxyl cuối.

Vì các protein không tiếp xúc trực tiếp với vị trí nhận biết trong DNA, chúng phải được dịch mã liên tiếp cho đến khi chúng đến vị trí cụ thể, có lẽ bằng các cơ chế "trượt" trên chuỗi DNA..

Trong quá trình cắt enzyme, liên kết phosphodiester của từng chuỗi DNA được định vị trong một trong những vị trí hoạt động của các enzyme cắt giới hạn. Khi enzyme rời khỏi vị trí nhận biết và cắt, nó sẽ thông qua các hiệp hội thoáng qua không đặc hiệu.

Các loại

Hiện nay, năm loại enzyme hạn chế được biết đến. Dưới đây, một mô tả ngắn gọn về mỗi:

Enzim hạn chế loại I

Những enzyme này là các protein ngũ giác lớn với ba tiểu đơn vị, một hạn chế, methyl hóa và một loại khác để nhận biết các chuỗi trong DNA. Các endonuclease này là các protein đa chức năng có khả năng xúc tác cho các phản ứng hạn chế và sửa đổi, chúng có hoạt tính ATPase và DNA topoisomerase.

Enzyme loại này là các endonuclease đầu tiên được phát hiện, chúng được tinh chế lần đầu tiên vào những năm 1960 và kể từ đó chúng đã được nghiên cứu rất sâu.

Enzim loại I không được sử dụng rộng rãi như một công cụ công nghệ sinh học, vì vị trí cắt có thể ở khoảng cách thay đổi lên tới 1.000 cặp cơ sở từ vị trí nhận biết, khiến chúng không đáng tin cậy về khả năng tái tạo thử nghiệm.

Enzim hạn chế loại II

Chúng là các enzyme bao gồm các homodimers hoặc tetramers cắt DNA tại các vị trí xác định có chiều dài từ 4 đến 8 bp. Các vị trí cắt này thường là palindromic, nghĩa là, chúng nhận ra các chuỗi được đọc theo cùng một cách theo cả hai hướng.

Nhiều enzyme hạn chế loại II ở vi khuẩn đã cắt DNA khi chúng nhận ra đặc điểm ngoại lai của chúng, vì chúng không có các sửa đổi điển hình mà DNA sở hữu nên có..

Đây là những enzyme hạn chế đơn giản nhất vì chúng không yêu cầu bất kỳ đồng yếu tố nào ngoài magiê (Mg +) để nhận biết và cắt các chuỗi DNA.

Độ chính xác của các enzyme cắt giới hạn loại II trong việc nhận biết và cắt các chuỗi đơn giản trong DNA ở các vị trí chính xác làm cho chúng trở thành một trong những thứ được sử dụng nhiều nhất và không thể thiếu trong hầu hết các ngành sinh học phân tử.

Trong nhóm các enzyme cắt giới hạn loại II có nhiều lớp con được phân loại theo các thuộc tính nhất định là duy nhất cho mỗi loại. Việc phân loại các enzyme này được thực hiện bằng cách thêm các chữ cái của bảng chữ cái, từ A đến Z theo tên của enzyme.

Một số lớp con được biết đến nhiều nhất vì tính hữu dụng của chúng là:

Phân lớp IIA

Chúng là dimers của các tiểu đơn vị khác nhau. Chúng nhận ra các chuỗi bất đối xứng và được sử dụng làm tiền chất lý tưởng cho việc tạo ra các enzyme cắt.

Phân lớp IIB

Chúng bao gồm một bộ điều chỉnh độ sáng và cắt DNA ở cả hai phía của chuỗi nhận dạng. Họ cắt cả hai chuỗi DNA trong một loạt các cặp cơ sở ngoài phạm vi nhận biết.

Phân lớp IIC

Enzyme thuộc loại này là các polypeptide có chức năng phân chia và biến đổi các chuỗi DNA. Các enzyme này cắt cả hai sợi không đối xứng.

Phân lớp IIE

Các enzyme của phân lớp này được sử dụng nhiều nhất trong kỹ thuật di truyền. Họ có một vị trí xúc tác và thường yêu cầu một bộ lọc allosteric. Các enzyme này cần tương tác với hai bản sao của trình tự nhận biết của chúng để tạo ra sự cắt giảm hiệu quả. Trong lớp con này là các enzyme EcoRII và EcoRI.

Enzim hạn chế loại III

Các endonuclease giới hạn loại III chỉ bao gồm hai tiểu đơn vị, một là chịu trách nhiệm nhận dạng và sửa đổi DNA, trong khi cái còn lại chịu trách nhiệm cắt chuỗi.

Những enzyme này đòi hỏi hai cofactors cho chức năng của chúng: ATP và magiê. Các enzyme hạn chế loại này có hai vị trí nhận dạng không đối xứng, dịch mã DNA theo cách phụ thuộc ATP và cắt nó trong khoảng từ 20 đến 30 bp liền kề với vị trí nhận biết..

Enzim hạn chế loại IV

Enzyme loại IV rất dễ xác định vì chúng cắt DNA bằng các thẻ methyl hóa, chúng được tạo thành từ một số tiểu đơn vị khác nhau chịu trách nhiệm nhận biết và cắt chuỗi DNA. Những enzyme này sử dụng làm đồng yếu tố GTP và magiê hóa trị hai.

Các vị trí cụ thể để cắt bao gồm chuỗi nucleotide có dư lượng cytosine bị methyl hóa hoặc hydroxymethylated trong một hoặc cả hai chuỗi axit nucleic.

Enzim hạn chế loại V

Phân loại này nhóm các enzyme loại CRISPER-Cas, xác định và cắt các chuỗi DNA cụ thể khỏi các sinh vật xâm nhập. Các enzyme Cas sử dụng một chuỗi RNA hướng dẫn tổng hợp CRISPER để nhận biết và tấn công các sinh vật xâm nhập.

Enzyme được phân loại là loại V là các polypeptide có cấu trúc bởi enzyme loại I, II và II. Họ có thể cắt các phần DNA của hầu hết mọi sinh vật và với một phạm vi dài. Tính linh hoạt và dễ sử dụng của chúng làm cho các enzyme này trở thành một trong những công cụ được sử dụng phổ biến nhất trong kỹ thuật di truyền ngày nay cùng với enzyme loại II.

Ví dụ

Các enzyme hạn chế đã được sử dụng để phát hiện các đa hình DNA, đặc biệt là trong các nghiên cứu về di truyền dân số và nghiên cứu tiến hóa sử dụng DNA ty thể, để có được thông tin về tỷ lệ thay thế nucleotide..

Hiện tại, các vectơ được sử dụng để chuyển đổi vi khuẩn với các mục đích khác nhau có các vị trí đa dòng trong đó các vị trí nhận biết cho nhiều enzyme cắt giới hạn được tìm thấy..

Trong số các enzyme này, những enzyme phổ biến nhất là EcoRI, II, III, IV và V, được thu thập và mô tả lần đầu tiên E.coli; HindIII, từ H. cúm và của BamHI B. amyloliquefaciens.

Tài liệu tham khảo

  1. Bickle, T. A., & Kruger, D. H. (1993). Sinh học hạn chế DNA. Nhận xét vi sinh, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A., & Horvath, P. (2007). CRISPR cung cấp sức đề kháng chống lại vi-rút ở sinh vật nhân sơ. Khoa học, 315(Tháng 3), 1709-1713.
  3. Hàng hóa, D. (2002). Quan điểm phân tử: Hạn chế Endonuclease. Tế bào gốc Cơ bản của Y học Ung thư, 20, 190-191.
  4. Halford, S. E. (2001). Nhảy, nhảy và vòng lặp bởi các enzyme hạn chế. Giao dịch sinh hóa xã hội, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Duy trì nhận dạng loài và kiểm soát sự phát hiện của vi khuẩn: một chức năng mới cho các hệ thống hạn chế / sửa đổi? Gen, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Genin XII (12 xuất bản). Burlington, Massachusetts: Học tập Jones & Bartlett.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... She, Q. (2015). Khai thác hệ thống CRISPR-Cas loại I và loại III để chỉnh sửa bộ gen. Nghiên cứu axit nucleic, 1-12.
  8. Loenen, W. A.M., Dryden, D.T. F., Raleigh, E.A., & Wilson, G.G. (2013). Enzim hạn chế loại I và họ hàng của chúng. Nghiên cứu axit nucleic, 1-25.
  9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Hạn chế Endonuclease trong phân tích và tái cấu trúc các phân tử DNA. Annu. Rev.., 273-293.
  10.  Nei, M., & Tajima, F. (1981). Đa hình Dna có thể được phát hiện bởi endonuclease hạn chế. Di truyền học, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Khoa học đời sống tế bào và phân tử Loại II endonuclease: cấu trúc và cơ chế. Khoa học đời sống tế bào và phân tử CMLS, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Làm thế nào các enzyme hạn chế trở thành con ngựa của sinh học phân tử. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R. J., & Murray, K. (1976). Hạn chế endonuclease. Nhận xét quan trọng trong hóa sinh, (Tháng 11), 123-164.
  14.  Stoddard, B. L. (2005). Cấu trúc và chức năng của endonuclease. Nhận xét hàng quý về vật lý sinh học, 1-47.
  15.  Tock, M. R., & Dryden, D. T. F. (2005). Sinh học của hạn chế và chống hạn chế. Ý kiến ​​hiện tại về vi sinh, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005,06.003
  16.  Wilson, G. G., & Murray, N. E. (1991). Hệ thống hạn chế và sửa đổi. Annu. Mục sư., 25, 585-627.
  17.  Ngô, Z., & Mou, K. (2016). Những hiểu biết về bộ gen về Campylobacter jejuni độc lực và di truyền quần thể. Lây nhiễm Dis. Dịch. Med., 2(3), 109-119.
  18.  Nguyên, R. (1981). Cấu trúc và cơ chế của endonuclease hạn chế đa chức năng. Annu. Rev.., 50, 285-315.