Chia sẻ:
Trình tự DNA Maxam-Gilbert, phương pháp Sanger, ví dụ
các Giải trình tự DNA (deoxyribonucleic acid) là một quy trình được thực hiện trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử cho phép biết thứ tự các nucleotide trong vật liệu di truyền quan tâm. Ngoài ra, trình tự của RNA (axit ribonucleic) cũng có thể được tiết lộ.
Kỹ thuật này đã không thể thiếu cho sự phát triển của khoa học sinh học. Nó cũng có thể áp dụng cho các lĩnh vực kiến thức khác - chẳng hạn như chẩn đoán y tế và điều tra pháp y, ví dụ.
Trước đây, việc giải trình tự chuỗi DNA được coi là một hoạt động chậm và tốn kém, cho phép xác định chỉ một vài cặp bazơ trong oligonucleotide.
Ngày nay, với tất cả những tiến bộ của khoa học, giải trình tự DNA là hoạt động thường xuyên ở nhiều phòng thí nghiệm trên toàn thế giới nhờ sự đóng góp của gần 50 năm nghiên cứu trong lĩnh vực này. Đối với độ dài của chuỗi, bạn có thể sắp xếp hàng triệu cặp cơ sở trong một thời gian rất ngắn.
Để làm như vậy, có hàng tá các kỹ thuật được phát triển khác nhau về giá cả và độ chính xác. Trong bài viết này, chúng tôi sẽ mô tả cả các kỹ thuật cổ điển và hiện đại, mỗi kỹ thuật đều có ưu điểm và nhược điểm..
Cho đến nay, các kỹ thuật giải trình tự cho phép thu được trình tự bộ gen hoàn chỉnh, từ sinh vật nhân sơ và nấm men nhỏ đến bộ gen người.
Chỉ số
- 1 Cấu trúc của DNA
- 2 Lịch sử
- Phương pháp 3 Sanger
- 3.1 Thành phần chính của phản ứng
- 3.2 Đọc kết quả
- 4 trình tự tự động
- 5 trình tự Maxam-Gilbert
- 5.1 Thủ tục
- 5.2 Đọc kết quả
- 6 trình tự lớn
- 6.1 Pyroinating
- 6.2 Trình tự tổng hợp
- 6.3 Trình tự bằng cách thắt
- 6.4 Trình tự ion torrent
- 7 ví dụ
- 7.1 Trình tự bộ gen người
- 8 Tầm quan trọng và ứng dụng
- 9 Tài liệu tham khảo
Cấu trúc của DNA
Để hiểu các phương pháp và kỹ thuật được sử dụng để giải trình tự DNA, cần phải biết một số khía cạnh quan trọng nhất định về cấu trúc và thành phần của phân tử.
DNA là một phân tử sinh học được tìm thấy trong tất cả các sinh vật sống, từ vi khuẩn đến động vật thủy sinh lớn. Các bào quan - như ty thể và lục lạp - có một phân tử DNA tròn bên trong chúng. Ngay cả trong một số virus, vật liệu di truyền được tìm thấy là DNA.
Về mặt cấu trúc, DNA là một tập hợp các nucleotide. Mỗi một được tích hợp bởi một carbohydrate, một cơ sở nitơ (A, T, C hoặc G) và một nhóm phosphate. Mục tiêu của giải trình tự DNA là tiết lộ thứ tự tìm thấy bốn bazơ nitơ trong trình tự.
Lịch sử
Vào giữa những năm 1950, các nhà nghiên cứu Watson và Crick đã mô tả cấu trúc của DNA bằng các kỹ thuật Kitô học. Tuy nhiên, không ai trong số các nhà nghiên cứu này có thể tìm ra cách để khám phá ra trình tự.
Mặc dù có những người tiền nhiệm nhất định, sự kiện quan trọng nhất là việc tạo ra phương pháp của Sanger, vào năm 1977. Frederick Sanger, cha đẻ của phương pháp này, là một nhà hóa sinh người Anh, đã giành được hai giải thưởng Nobel vì những đóng góp to lớn của ông cho khoa học sinh học.
Kỹ thuật này cũng được biết đến trong tài liệu là "chấm dứt chuỗi" hoặc dideoxynucleotide. Tiếp theo chúng tôi sẽ mô tả các nguyên tắc của kỹ thuật này và những nguyên tắc được phát triển dựa trên sự cải tiến và đổi mới của điều này.
Phương pháp của Sanger
Sự phát triển của phương pháp Sanger là một sự kiện quan trọng trong sinh học phân tử. Nó liên quan đến các thành phần cơ bản của quá trình sao chép DNA thường xảy ra trong tế bào, nhưng bằng cách thêm một thành phần đặc biệt: dideoxynucleotide.
Thành phần chính của phản ứng
- DNA polymerase: enzyme DNA polymerase là một yếu tố quan trọng của quá trình. Phân tử này tham gia vào quá trình sao chép chuỗi DNA và vai trò của nó là tổng hợp chuỗi mới, phù hợp với deoxyribonucleotides triphosphate với các chuỗi bổ sung.
Hãy nhớ rằng trong DNA, các thymine (T) được ghép với adenine (A) bằng hai liên kết hydro, trong khi cytosine (C) thực hiện với guanine (G) bằng ba cầu.
- Nucleotide: Giải trình tự Sanger bao gồm hai loại nucleotide, bốn 2'-deoxynucleotide (viết tắt là dATP, dGTP, dCTP và dTTP) và bốn dideoxynucleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP và ddTTP.
Mặc dù dideoxynucleotide tương tự như các monome thường được tích hợp vào DNA, chúng thiếu một nhóm -OH trong cấu trúc của chúng. Điều này làm cho không thể thêm một nucleotide mới vào chuỗi.
Do đó, khi một nucleotide đặc biệt được thêm vào - theo cách hoàn toàn ngẫu nhiên - cho chuỗi hình thành, quá trình tổng hợp bị tê liệt. Theo cách này, vào cuối phản ứng, có các chuỗi có kích cỡ khác nhau, mỗi chuỗi phản ứng dừng lại ở một điểm khác nhau.
Thực nghiệm, bốn thử nghiệm được chuẩn bị. Mỗi loại chứa DNA được chiết xuất từ mẫu sinh học quan tâm, các nucleotide bình thường và một trong bốn loại nucleotide đặc biệt. Hoặc các nucleotide đặc biệt được đánh dấu bằng một số loại dấu huỳnh quang (xem trình tự tự động bên dưới).
Đọc kết quả
Bước đầu tiên là tách từng chuỗi tổng hợp theo kích thước của chúng. Một số sẽ dài hơn những cái khác, tùy thuộc vào nơi các căn cứ đặc biệt được kết hợp.
Có các kỹ thuật sinh hóa khác nhau cho phép tách các thành phần của hỗn hợp bằng cách sử dụng kích thước như một đặc tính phân biệt đối xử. Trong phương pháp Sanger, các chuỗi khác nhau được phân tách bằng điện di. Trong các biến thể tinh vi nhất của kỹ thuật, điện di mao quản được sử dụng.
Do đó, các sợi dài di chuyển ít hơn các biến thể ngắn hơn. Sau đó, hệ thống này đi qua một trình đọc nhận ra điểm đánh dấu có trong mỗi dideoxynucleotide. Theo cách này, thứ tự của chuỗi có thể được biết.
Kỹ thuật "thế hệ thứ nhất" này có thể đọc các đoạn DNA không lớn hơn 1 kilobase. Hiện tại, phương pháp của Sanger được sử dụng trong một số phòng thí nghiệm, thường là trong các biến thể hiện đại của nó. Ngoài ra, nó được sử dụng để chứng thực các kết quả thu được bằng các kỹ thuật phức tạp nhất - nhưng ít chính xác hơn.
Trình tự tự động
Khi giải trình tự quy mô lớn là cần thiết, quá trình này được tăng tốc bằng tự động hóa. Đây là một biến thể của phương pháp chấm dứt chuỗi Sanger, trong đó các mồi được đánh dấu bằng các sản phẩm huỳnh quang để phân biệt chúng.
Sau đó, sản phẩm của phản ứng được chạy trong điện di - tất cả trong một làn. Khi mỗi mảnh rời khỏi phần cuối cùng của gel, nó sẽ nhanh chóng được xác định bởi nhãn huỳnh quang của nó, với sai số bao quanh 1%.
Các hệ thống tinh vi nhất có một hệ thống lên tới 96 ống mao dẫn được vận hành bởi một máy tính được ghép nối với robot. Đó là, 96 mẫu DNA có thể được đánh giá đồng thời. Do đó, quá trình liên quan đến điện di và phân tích kết quả là hoàn toàn tự động.
Trong một ngày, các hệ thống này có thể sắp xếp thứ tự lên tới 550.000 căn cứ. Trong quá trình, công việc của con người là không cần thiết, chỉ mất khoảng 15 phút để bắt đầu phương pháp.
Giải trình tự của Maxam-Gilbert
Cùng lúc Sanger công bố công trình của mình, hai nhà nghiên cứu tên Allan Maxan và Walter Gilbert đã phát triển một phương pháp khác để thu được chuỗi DNA. Phương pháp này đã trở nên phổ biến vào thời điểm đó, nhưng sau đó đã bị thay thế bởi sự cải tiến của phương pháp Sanger.
Trái với phương pháp của Sanger, trình tự Maxan và Gilbert (hoặc giải trình tự hóa học, như nó cũng được biết) không liên quan đến các phản ứng lai hóa. Phương pháp này bao gồm đánh dấu bằng các tác nhân phản ứng ở một đầu, sau đó là quá trình thanh lọc.
Một trong những khía cạnh tiêu cực của kỹ thuật này nằm ở sự phức tạp to lớn của nó và trong việc sử dụng các hóa chất gây nguy hiểm cho người dùng. Sự cố hóa học được gây ra bởi việc áp dụng DMS, axit formic, hydrazine và hydrazine với muối.
Thủ tục
Giao thức bắt đầu với việc ghi nhãn ở đầu 5 'của sợi với dấu hiệu phốt pho 32, sau đó xảy ra sự biến đổi hóa học của bazơ nitơ và nó được tách ra. Cuối cùng, sự chia tách vùng abasic xảy ra.
Đầu tiên, chuỗi được sắp xếp theo trình tự được rút ngắn thành các phân đoạn nhỏ hơn. Bước này được thực hiện với các enzyme cắt giới hạn, dẫn đến các cực trị xuất sắc.
Tiếp theo, phản ứng được thực hiện với một phosphatase kiềm, với mục đích là loại bỏ nhóm phốt phát. Do đó, một polynucleotide kinase có thể được sử dụng để thực hiện ghi nhãn.
Chuỗi bị biến tính (hai sợi mở). Sau đó chúng tôi tiến hành áp dụng các hóa chất. Các phản ứng phân cắt này được thực hiện một cách có kiểm soát và loại liên kết nào bị phá vỡ bởi mỗi hóa chất được áp dụng.
Đọc kết quả
Như trong phương pháp Sanger, việc đọc kết quả liên quan đến việc phân tách theo kích thước của chuỗi thu được trong hệ thống điện di. Các hệ thống bao gồm polyacrylamide cho phép thu được độ phân giải rất phù hợp để đọc gel.
Giải trình tự lớn
Giải trình tự lớn bao gồm một loạt các phương pháp mới, viết tắt là NGS, từ tiếng Anh "Trình tự thế hệ tiếp theo ".
Các phương pháp được liệt kê là NGS yêu cầu một bước khuếch đại DNA trước đó (chúng không hoạt động với một phân tử đơn lẻ). Ngoài ra, các nền tảng được sử dụng rất khác nhau. Các nguyên tắc của các phương pháp phổ biến nhất sẽ được mô tả dưới đây:
Kết quả
Nó liên quan đến việc theo dõi sự giải phóng của một pyrophosphate, xảy ra mỗi khi một nucleotide mới được thêm vào chuỗi DNA. Một hệ thống enzyme được ghép nối, do đó sự phát xạ ánh sáng (có thể phát hiện được bằng máy ảnh) xảy ra mỗi khi một nucleotide mới được kết hợp.
Quá trình bắt đầu với việc ủ riêng từng cơ sở nitơ để xác minh xem có phát xạ ánh sáng hay không. Pyroinating có thể thực hiện việc đọc các chuỗi dài, nhưng tỷ lệ lỗi được tìm thấy là cao.
Sắp xếp theo tổng hợp
Điều này liên quan đến việc kết hợp các nucleotide được dán nhãn. Các thành phần huỳnh quang này được thêm vào, rửa và nucleotide kết hợp được ghi nhận. Sau đó, việc ghi nhãn nucleotide được loại bỏ và quá trình tổng hợp chuỗi có thể tiếp tục. Trong bước tiếp theo, một nucleotide được dán nhãn cũng sẽ được kết hợp và các bước được đề cập sẽ được lặp lại.
Một nhược điểm với kỹ thuật này xảy ra khi các điểm đánh dấu huỳnh quang không được loại bỏ hoàn toàn. Những khí thải này tạo ra lỗi nền, dẫn đến lỗi đáng kể.
Trình tự bằng cách thắt
Kỹ thuật này thay đổi so với các kỹ thuật khác, vì nó không sử dụng DNA polymerase. Thay vào đó, enzyme chủ chốt cho phương pháp này là ligase. Dưới đây là các đoạn DNA được sử dụng có nhãn huỳnh quang, được liên kết bởi enzyme và được phát hiện.
Vấn đề lớn nhất với kỹ thuật này là đoạn dài rất ngắn có khả năng xử lý.
Trình tự ion torrent
Kỹ thuật này dựa trên phép đo ion H+ được giải phóng mỗi khi một nucleotide mới được kết hợp. Nguyên tắc này khá giống với pyroinating, nhưng rẻ hơn nhiều.
Ví dụ
Trình tự bộ gen của con người
Giải trình tự bộ gen của con người là một trong những thách thức hứa hẹn nhất trong sinh học, cũng như là một trong những cuộc cạnh tranh được hoan nghênh nhất trong lịch sử khoa học. Trên thực tế, đối với các nhà khoa học tham gia dự án, giải trình tự bộ gen đã trở thành một cuộc cạnh tranh.
Năm 1990, ông bắt đầu cái gọi là "dự án bộ gen người", dẫn đầu bởi nhà khoa học nổi tiếng, người giành giải thưởng Nobel, James Watson. Sau một năm, vào năm 1991, Venter đã thực hiện thử thách "đánh bại" Watson và giải trình tự bộ gen trước anh. Tuy nhiên, vào năm 1992, Watson đã nghỉ hưu và lệnh này được thực hiện bởi một nhà nghiên cứu khác.
Năm 1995, Venter tuyên bố thành công trong việc giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự ngẫu nhiên. Tương tự, nhóm đối diện tuyên bố một năm sau đó giải trình tự bộ gen nấm men.
Vào năm 2000, cuộc đua đã chấm dứt. Cả hai công ty đã công bố kết quả sơ bộ của họ về bộ gen hoàn chỉnh trong hai tạp chí uy tín nhất trong khoa học: Thiên nhiên và Khoa học.
Tuy nhiên, các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu cải tiến các đề xuất và vào năm 2006, các trình tự đã được hoàn thành một số nhiễm sắc thể của con người.
Tầm quan trọng và ứng dụng
Biết thứ tự các nucleotide của một phân tử cũng quan trọng như DNA có giá trị đối với các nhà sinh học và các chuyên gia liên quan. Chuỗi polynucleotide này chứa tất cả các thông tin cần thiết cho sự phát triển và duy trì của tất cả các dạng sống.
Vì những lý do này, kiến thức về trình tự này rất cần thiết cho nghiên cứu sinh học. Về cơ bản, giải trình tự cho phép chúng ta đo lường một trong những tính chất quan trọng nhất của hệ thống sinh học và thiết lập sự khác biệt giữa chúng.
Trình tự được sử dụng rộng rãi bởi các nhà phân loại và nhà hệ thống, vì các trình tự DNA nhất định cho phép thiết lập các tiêu chí để kết luận liệu hai sinh vật có thuộc cùng một loài hay không, cũng như có thể đưa ra các giả thuyết về mối quan hệ phát sinh gen giữa chúng..
Ngoài ra, giải trình tự DNA có các ứng dụng trong lĩnh vực y học và chẩn đoán. Ví dụ, có những hệ thống giá cả phải chăng và dễ tiếp cận, thông qua giải trình tự, cho phép chúng ta đánh giá xu hướng phát triển một số bệnh (như ung thư) bằng cách sử dụng cái gọi là đa hình nucleotide đơn giản (SNP)..
Các cuộc điều tra thuộc loại tội phạm và pháp y cũng đã được làm phong phú với các kỹ thuật giải trình tự, và có thể được sử dụng làm bằng chứng đáng tin cậy về sự tham gia của một cá nhân nào đó trong một tội phạm.
Tài liệu tham khảo
- Heather, J. M., & Chuỗi, B. (2016). Trình tự sắp xếp thứ tự: lịch sử của trình tự DNA. Bộ gen, 107(1), 1-8.
- Koboldt, D.C., Steinberg, K.M., Larson, D.E., Wilson, R.K., & Mardis, E.R. (2013). Thế hệ tiếp theo của cuộc cách mạng giải trình tự và tác động của nó đối với bộ gen. Tế bào, 155(1), 27-38.
- Levy, J. (2010). Sự cạnh tranh khoa học. Từ Galileo đến dự án bộ gen của con người. Biên tập Paraninfo.
- Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A. R. (1977). Trình tự DNA với các chất ức chế kết thúc chuỗi. Kỷ yếu của học viện khoa học quốc gia, 74(12), 5463-5467.
- Schuster, S. C. (2007). Giải trình tự thế hệ tiếp theo biến đổi sinh học ngày nay. Phương pháp tự nhiên, 5(1), 16.
- Xu, J. (Ed.). (2014). Trình tự thế hệ tiếp theo. Báo chí học thuật Caister.