Agar có nền tảng tiêu chuẩn, chuẩn bị và sử dụng

các tài khoản agar tiêu chuẩn là một môi trường nuôi cấy rắn, không chọn lọc, được thiết kế để định lượng tải lượng vi khuẩn hiếu khí có trong các mẫu nước uống, nước thải, thức uống sữa, trong số các thực phẩm khác. Phương tiện này còn được gọi là môi trường thạch PCA, vì từ viết tắt của tiếng Anh là Count Count Agar. Nó được tạo ra vào năm 1953 bởi Buchbinder, Baris và Goldstein.

Tài khoản môi trường thạch tiêu chuẩn bao gồm chiết xuất men, triptein, glucose, agar và nước cất. Công thức này chứa các yếu tố dinh dưỡng cơ bản cho phép phát triển tải lượng vi sinh vật hiếu khí hiện tại, không đòi hỏi.

Vì môi trường không chứa chất ức chế, vi khuẩn có thể phát triển mà không có bất kỳ hạn chế nào, vì vậy nó rất lý tưởng cho số lượng khuẩn lạc nói chung. Tuy nhiên, kỹ thuật định lượng tấm sẽ không phát hiện được tất cả các vi khuẩn có mặt, mà chỉ những vi khuẩn có khả năng phát triển trong điều kiện môi trường mà môi trường thạch gieo chuẩn phải chịu..

Theo nghĩa này, kỹ thuật định lượng tấm tìm cách xác định chung lượng vi khuẩn hiếu khí hiếu khí, nghĩa là những vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ từ 25 đến 40 ° C, với nhiệt độ tăng trưởng tối ưu ở 37 ° C.

Nhóm vi khuẩn này rất quan trọng, vì có hầu hết các vi khuẩn gây bệnh cho con người.

Cần lưu ý rằng đôi khi có thể thú vị để định lượng lượng vi khuẩn loạn thần có trong thực phẩm. Những vi khuẩn này là những vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ thấp (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.

Tương tự như vậy, vi khuẩn ưa nhiệt, phát triển trong khoảng từ 50 ° C đến 80 ° C trở lên, có thể quan trọng trong một số loại thực phẩm như đóng hộp.

Định lượng vi sinh vật được biểu thị bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên mỗi gam hoặc mililit mẫu.

Chỉ số

• 1 nền tảng
• Chuẩn bị 2
  • 2.1 Đối với kỹ thuật đổ tấm
  • 2.2 Để trồng bề mặt
• 3 Sử dụng
  • 3.1 Kỹ thuật rót tấm (gieo hạt theo độ sâu)
  • 3.2 Kỹ thuật gieo trên bề mặt
• 4 Kiểm soát chất lượng
• 5 hạn chế
• 6 tài liệu tham khảo

Nền tảng

Môi trường đếm tiêu chuẩn được thiết kế để cho phép sự phát triển thỏa đáng của vi khuẩn hiếu khí không đòi hỏi, vì chiết xuất nấm men, tripheine và glucose cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn tốt.

Mặt khác, môi trường có màu sắc rõ ràng và bề ngoài trong suốt, đó là lý do tại sao nó lý tưởng để hiển thị các khuẩn lạc được phát triển bằng phương pháp gieo sâu (đổ vào một cái đĩa).

Cũng có thể đếm các khuẩn lạc bằng phương pháp gieo trên bề mặt bằng thìa Drigalski.

Khi tải lượng vi sinh vật cao, pha loãng thập phân của mẫu nghiên cứu phải được thực hiện để đếm CFU.

Cần lưu ý rằng phương tiện này được Hiệp hội Y tế Công cộng Hoa Kỳ (APHA) khuyến nghị để đếm các mesophile hiếu khí.

Chuẩn bị

Cân 23,5 gr môi trường khử nước và hòa tan trong một lít nước cất. Để hòa tan hoàn toàn, hỗn hợp phải được đun nóng khuấy thường xuyên cho đến khi sôi. Các bước sau phụ thuộc vào kỹ thuật gieo hạt được sử dụng.

Đối với kỹ thuật đổ tấm

Phân phối bằng cách phân phối 12 đến 15 ml vào ống nghiệm. Sau đó, khử trùng trong nồi hấp ở 121 ° C trong 15 phút. Cho phép hóa rắn theo chiều dọc ở dạng khối. Bảo quản trong tủ lạnh cho đến khi sử dụng.

Làm tan chảy tín hiệu khi nó sẽ được sử dụng. Sau khi tan chảy, giữ nó trong bể nước ở nhiệt độ 44-47 ° C trong khi mẫu đang được chuẩn bị.

Để trồng trên bề mặt

Khử trùng môi trường trong nồi hấp ở 121 ° C và sau đó phân phối 20 ml trong đĩa petri vô trùng. Cho phép hóa rắn, đảo ngược và bảo quản trong tủ lạnh cho đến khi sử dụng.

Ủ các tấm trước khi sử dụng. Độ pH của môi trường phải là 7,0 ± 0,2.

Sử dụng

Số lượng tiêu chuẩn agar được sử dụng trong kỹ thuật đếm mesophil hiếu khí trong quá trình phân tích vi sinh học của nước và thực phẩm. Việc đếm mesophiles hiếu khí là cần thiết, vì nó quyết định chất lượng vệ sinh của mẫu đang nghiên cứu.

Việc áp dụng kỹ thuật này (sử dụng phương tiện này) cho phép hình dung vĩ mô của các khuẩn lạc biệt lập để định lượng.

Kỹ thuật đổ mảng bám (gieo hạt theo chiều sâu)

-Thủ tục

Kỹ thuật này bao gồm:

1) Đồng nhất hóa mẫu để phân phối lại vi khuẩn có mặt.

2) Việc đình chỉ ban đầu được thực hiện trong lọ hoặc túi vô trùng, tuân theo tỷ lệ 10 g hoặc 10 ml mẫu trong 90 ml dung dịch pha loãng (10^-1).

3) Từ huyền phù ban đầu, pha loãng thập phân có liên quan được thực hiện tùy thuộc vào loại mẫu. Vd: (10^-2, 10^-3, 10^-4). Việc pha loãng được thực hiện với nước peptone hoặc đệm phosphate.

Để làm điều này, lấy 1 ml huyền phù ban đầu và đặt vào 9 ml dung dịch pha loãng, tiếp tục pha loãng nếu cần thiết, lấy ngay 1 ml dung dịch pha loãng.^-2 và v.v..

4) Lấy 1 ml mỗi lần pha loãng và đặt vào đĩa Petri vô trùng rỗng.

5) Thêm vào mỗi đĩa 12 đến 15 ml agar đếm tiêu chuẩn đã tan chảy trước đó và đặt ở 44 - 47 ° C.

6) Tạo chuyển động quay trơn tru cho các tấm để phân phối mẫu vào môi trường thạch đồng đều và cho phép hóa rắn.

7) Đảo ngược đĩa và ủ ở 37 ° C trong aerobiosis trong 24 đến 48 giờ.

8) Sau khi thời gian kết thúc, tiến hành kiểm tra các tấm và đếm các khuẩn lạc trong độ pha loãng cho phép. Nó được chọn để đếm những tấm có từ 30 đến 300 CFU.

Việc đếm có thể được thực hiện bằng tay hoặc thiết bị đếm khuẩn lạc có thể được sử dụng.

Các giá trị được phép cho mỗi ml mẫu có thể thay đổi từ nước này sang nước khác theo tiêu chuẩn mà theo đó chúng được quản lý.

-Tính toán của UFC

Tính toán chung được thực hiện bằng công thức sau:

Thể hiện kết quả bằng 1 hoặc 2 chữ số, nhân với số 10 thích hợp. Ví dụ: nếu kết quả là 16.545, nó được làm tròn dựa trên chữ số thứ ba thành 17.000 và sẽ được biểu thị như sau: 1.7 x 10⁴. Bây giờ, nếu kết quả là 16.436 được làm tròn thành 16.000 và được biểu thị 1.6 x 10⁴.

Kỹ thuật trồng trên bề mặt

-Thủ tục

-Cấy 0,1 ml mẫu trực tiếp nếu nó ở dạng lỏng, huyền phù ban đầu 10^-1 hoặc pha loãng liên tiếp 10^-2, 10^-3 vv, ở giữa một tấm thạch tài khoản tiêu chuẩn.

-Phân phối mẫu đều bằng thìa Drigalski hoặc que thủy tinh hình chữ L. Để yên trong 10 phút.

-Đảo ngược đĩa và ủ trong aerobiosis ở 37 ° C trong 24 đến 48 giờ.

-Tiến hành đếm các khuẩn lạc, chọn những tấm nằm trong phạm vi từ 20 - 250 CFU.

-Tính toán của UFC

Đối với tính toán, hệ số pha loãng được áp dụng, đó là nghịch đảo. Số được làm tròn thành 2 chữ số có nghĩa (làm tròn theo chữ số thứ ba) và được biểu thị bằng công suất cơ sở 10. Ví dụ: nếu 224 CFU được tính trong mẫu mà không pha loãng (10^-1), 22 x 10 được báo cáo¹  UFC, nhưng nếu con số là 225, nó được báo cáo 23 x 10¹ UFC.

Bây giờ, nếu bạn đếm 199 CFU trong pha loãng 10^-3, 20 x 10 sẽ được báo cáo⁴ UFC, nhưng nếu 153 CFU được tính trong cùng độ pha loãng, 15 x 10 sẽ được báo cáo⁴ UFC.

Kiểm soát chất lượng

Môi trường nuôi cấy đếm tiêu chuẩn có thể được đánh giá bằng cách sử dụng các chủng đã được chứng nhận, như: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus Subilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus biểu bì ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Nếu môi trường nuôi cấy ở điều kiện tối ưu, sẽ có sự tăng trưởng thỏa đáng trong mọi trường hợp, ngoại trừ L. fermentum có thể có một hiệu suất thường xuyên.

Để đánh giá tính vô trùng của môi trường nuôi cấy, một hoặc hai đĩa của mỗi mẻ đã chuẩn bị (không được nuôi cấy) nên được ủ ở 37 ° C trong aerobiosis trong 24 giờ. Vào cuối thời gian này, không nên quan sát sự tăng trưởng hoặc thay đổi màu sắc của môi trường..

Hạn chế

-Không làm tan chảy thạch nhiều lần.

-Môi trường đã chuẩn bị có thể tồn tại đến 3 tháng miễn là nó được giữ trong tủ lạnh và tránh ánh sáng.

-Phương tiện này không thích hợp cho các vi sinh vật đòi hỏi, cũng không phải vi khuẩn kị khí.

Tài liệu tham khảo

1. Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Quốc gia (ANMAT). Phân tích vi sinh thực phẩm, phương pháp phân tích chính thức, vi sinh vật chỉ thị. 2014 Tập 3. Có tại: anmat.gov.ar
2. Phòng thí nghiệm Difco Francisco Soria Melguizo, S.A. Đếm Agar. 2009. Có sẵn tại: http://f-soria.es
3. Phòng thí nghiệm Conda Pronadisa. Agar cho các phương pháp tiêu chuẩn (PCA) theo APHA và ISO 4833. Có sẵn tại: condalab.com
4. Phòng thí nghiệm Britania. Đếm trên đĩa thạch. 2015. Có sẵn tại: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B và Velázquez O. 2009. Kỹ thuật phân tích vi sinh thực phẩm. Tái bản lần 2 Khoa Hóa học, UNAM. Mexico Có sẵn tại: depa.fquim.unam