Agar M.R.S nền tảng, chuẩn bị và sử dụng

các thạch M.R.S. là một môi trường nuôi cấy rắn chọn lọc, được sử dụng để phân lập và đếm vi khuẩn axit lactic, đặc biệt là chi Lactobacillus. Agar này được tạo ra vào năm 1960 bởi Man, Rogosa và Sharpe, phần giữa mang cùng tên, nhưng do tính phức tạp của nó, chữ viết tắt M.R.S thường được sử dụng..

Nó bao gồm peptone proteose, chiết xuất thịt, chiết xuất nấm men, glucose, sorbitan monoleate, dipotali phosphate, natri acetate, ammonium citrate, magiê sulfate, mangan sulfate và agar..

Thành phần này cho phép sự phát triển thích hợp của vi khuẩn axit lactic từ các mẫu lâm sàng, chẳng hạn như phân, dịch tiết âm đạo, mẫu miệng và sữa mẹ, cũng như các thực phẩm từ sữa và thịt..

Nó không được sử dụng thường xuyên trong các phòng thí nghiệm lâm sàng, vì vi khuẩn axit lactic hiếm khi tham gia vào các quá trình bệnh lý. Tuy nhiên, việc sử dụng M.R.S agar thường xuyên hơn trong lĩnh vực vi sinh thực phẩm..

Mặt khác, phương tiện này được sử dụng bởi một số Trung tâm nghiên cứu có mục tiêu là nghiên cứu vi khuẩn axit lactic.

Chỉ số

• 1 nền tảng
• Chuẩn bị 2
• 3 công dụng
  • 3.1 Đặc điểm của các thuộc địa
  • 3.2 Phân lập vi khuẩn axit lactic
  • 3.3 Đếm vi khuẩn axit lactic
  • 3,4 Ở cấp độ nghiên cứu
• 4 Kiểm soát chất lượng
• 5 tài liệu tham khảo

Nền tảng

Man agar, Rogosa và Sharpe có thành phần khá phức tạp. Bằng cách phá vỡ chức năng mà mỗi thành phần của nó đáp ứng, nền tảng của nó có thể được giải thích.

Proteose peptone, chiết xuất thịt, chiết xuất men và glucose là các chất dinh dưỡng cung cấp nguồn carbon, nitơ, vitamin và khoáng chất cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn. Ngoài ra, glucose là nguồn năng lượng phổ quát được sử dụng trong hầu hết các môi trường nuôi cấy.

Mặt khác, để thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn axit lactic, sự hiện diện của các cofactors (cation) không thể thiếu trong quá trình chuyển hóa Lactobacillus và các vi khuẩn liên quan là cần thiết; Các hợp chất này là muối natri, magiê và mangan.

Tương tự như vậy, sorbitan monoleate hoặc polysorbate 80 là một nguồn axit béo quan trọng khi được hấp thụ dưới dạng chất dinh dưỡng.

Ngoài ra, sorbitan monoleate và ammonium citrate hoạt động bằng cách ức chế sự phát triển của hệ thực vật đi kèm, đặc biệt là vi khuẩn gram âm, cung cấp đặc tính chọn lọc của loại thạch này.

Cuối cùng, agar-agar là thứ mang lại sự nhất quán vững chắc cho môi trường.

Có các biến thể khác của thạch Man Rogosa Sharpe; một trong số đó là một loại được bổ sung cysteine ​​(M.R.S.c), rất hữu ích cho việc phân lập bifidobacteria, trong số các vi sinh vật khác. Mặt khác, có môi trường MRS được bổ sung neomycin, paromomycin, axit nalidixic và lithium clorua, đặc biệt là để đếm bifidobacteria chọn lọc trong các sản phẩm sữa.

Chuẩn bị

Cân 68,25 gam môi trường khử nước và hòa tan trong một lít nước cất. Để yên trong 5 phút. Để hòa tan hoàn toàn, hãy mang đến một nguồn nhiệt khuấy thường xuyên và để sôi trong 1 đến 2 phút. Tiệt trùng trong nồi hấp ở 121 ° C trong 15 phút.

Khi để nồi hấp, hãy để vài phút và phân phối vẫn còn nóng trong các đĩa petri vô trùng.

Cho phép hóa rắn và đảo ngược các tấm, đặt hàng trong plaquers và lưu trữ trong tủ lạnh cho đến khi sử dụng. Cho phép các tấm lấy nhiệt độ phòng trước khi sử dụng chúng.

Độ pH của môi trường nên là 6,4 ± 0,2. Một số nhà thương mại khuyến nghị pH trong khoảng từ 5,5 đến 5,9.

Môi trường mất nước là màu be và chuẩn bị là màu hổ phách tối.

Cả môi trường khử nước và các tấm chuẩn bị nên được bảo quản ở 2 đến 8 ° C.

Công dụng

Các tấm thạch M.R.S. chúng có thể được gieo trên bề mặt (kiệt sức hoặc bằng thìa của Drigalski). Nó cũng có thể được gieo theo độ sâu. Các tấm nên được ủ ở 37 ° C trong microaerophilic (4% O₂ và 5-10% CO₂) trong 24 đến 72 giờ.

Phương pháp gieo hạt được chọn theo mục đích theo đuổi (cách ly hoặc đếm).

Đặc điểm của các thuộc địa

Các khuẩn lạc được cho là của Lactobacillus phát triển màu trắng và có hình dạng nhầy hoặc kem trên môi trường thạch này. Sau đó, họ phải xác định.

Phân lập vi khuẩn axit lactic

Đối với mục đích này, việc trồng bằng bề mặt được sử dụng. Các mẫu được trồng đòi hỏi một quy trình trước đó. 

Trong trường hợp mẫu sữa mẹ, nên ly tâm 1 ml mẫu ở 14.000 rmp trong 10 phút, để loại bỏ lớp mỡ. 900 μl bị loại bỏ, và trong 100 l còn lại, trầm tích bị đình chỉ và đổ lên M.R.S. Sau đó, nó phải được phân phối đều với một thìa Drigalski.

Trong trường hợp mẫu phân, một (1) gram phân được cân và đồng nhất trong 9 ml nước pepton khử trùng 0,1%, tương ứng với độ pha loãng 1/10. Sau đó pha loãng nối tiếp được thực hiện, cho đến khi đạt được độ pha loãng cuối cùng là 10^-4.

Cuối cùng, 100 μl độ pha loãng 10 được thực hiện^-2, 10^-3 và 10^-4 và mỗi độ pha loãng được gieo trên môi trường thạch MRS, phân phối đồng đều với thìa Drigalski.

Đếm vi khuẩn axit lactic

Trong trường hợp này, việc gieo hạt được thực hiện theo độ sâu.

Đối với các mẫu sữa mẹ, lấy 1 mL và đặt vào ống nhựa hình nón vô trùng. Môi trường thạch MRS được thêm vào ở nhiệt độ khoảng 40 ° C đến thể tích cuối cùng là 25 mL, thu được hỗn hợp đồng nhất. Sau đó, nó được đổ vào đĩa petri vô trùng một cách thống nhất và được phép đứng cho đến khi nó trùng hợp..

Pha loãng được thực hiện cho các mẫu phân, như mô tả ở trên. Lấy 1 ml mỗi độ pha loãng và đặt vào ống nhựa hình nón vô trùng. Agar MRS nóng chảy được thêm vào thể tích 25 mL.

Hỗn hợp của mỗi độ pha loãng được đổ đồng đều vào đĩa Petri vô trùng. Cuối cùng để cho nó đứng cho đến khi trùng hợp của nó.

Ở cấp độ nghiên cứu

Mỗi ngày nghiên cứu về vi khuẩn axit lactic trở nên thú vị hơn; đặc biệt là các nhà nghiên cứu tìm cách biết các chủng mới và tiềm năng của chúng khi bắt đầu lên men để tiêu chuẩn hóa trong sản xuất các sản phẩm sữa, trong số các ứng dụng khác.

Theo nghĩa này, Alvarado et al. (2007) đã sử dụng agar M.R.S. để thực hiện một nghiên cứu trong đó họ phân lập, xác định và xác định vi khuẩn axit lactic có trong một pho mát Venezuela hun khói của nghệ nhân.

Trong phô mai, họ đã tìm thấy sự hiện diện của vi khuẩn của Lactococcus và Lactobacillus, và kết luận rằng hỗn hợp các chủng phân lập là phù hợp như các chủng khởi đầu trong sản xuất pho mát từ sữa tiệt trùng.

Mặt khác, Sánchez et al. (2017) đã sử dụng agar M.R.S. điều tra sự hiện diện của vi khuẩn axit lactic trong đường tiêu hóa của heo con, để sử dụng chúng làm men vi sinh tự nhiên làm tăng năng suất của heo con khỏe mạnh.

Với phương tiện này, họ đã tìm cách cô lập bốn loài: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae và Pediococcus pentosaceus.

Tương tự như vậy, Báez et al. (2019) đã sử dụng agar M.R.S. để đánh giá vi khuẩn lactic (BAL) và bifidobacteria có tiềm năng sinh học trong sữa mẹ và phân của trẻ sơ sinh.

Họ quản lý để cô lập 11 BAL và 3 Bifidobacteria sp trong sữa mẹ, và 8 BAL và 2 Bifidobacteria sp. trong phân Tất cả đều đáp ứng các thông số nhất định công nhận chúng là vi khuẩn có hoạt tính sinh học.

Các tác giả kết luận rằng cả sữa mẹ và phân của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ đều là nguồn vi khuẩn sinh học tự nhiên.

Kiểm soát chất lượng

Để đánh giá chất lượng của M.R.S. các chủng kiểm soát có thể được sử dụng như:

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus Lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29353, Escherichia coli và Bacillus cereus.

Kết quả dự kiến ​​là sự tăng trưởng thỏa đáng cho 6 vi khuẩn đầu tiên, trong khi E.coli và Bacillus cereus phải bị ức chế toàn bộ.

Tài liệu tham khảo

1. Alvarado C, Chacón Z, Otoniel J, Guerrero B, López G. Phân lập, nhận dạng và đặc tính của vi khuẩn axit lactic từ một loại phô mai Venezuela hun khói thủ công Andean. Sử dụng của nó như là bắt đầu tu luyện. Nhà khoa học (Maracaibo) 2007; 17 (3): 301-308. Có sẵn tại: scielo.org.
2. Sánchez H, Fabián F, Ochoa G, Alfaro Phân lập vi khuẩn axit lactic từ đường tiêu hóa của heo con. Rev điều tra. bác sĩ thú y Peru 2017; 28 (3): 730-736. Có sẵn tại: scielo.org.
3. Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Đánh giá vi khuẩn axit lactic và Bifidobacteria có tiềm năng sinh học trong sữa mẹ và phân của trẻ sơ sinh ở đô thị Acevedo, Miranda 2017. Đại học đủ điều kiện để nhận bằng Cử nhân. Phân tích sinh học Đại học Carabobo, Venezuela.
4. Phòng thí nghiệm Anh M.R.S agar. 2015. Có sẵn tại: britanialab.com
5. Wikipedia đóng góp. Thạch MRS Wikipedia, bách khoa toàn thư miễn phí. Ngày 10 tháng 1 năm 2018, 19:44 UTC. Có sẵn tại: wikipedia.org Truy cập ngày 17 tháng 2 năm 2019.
6. Roy D. Media cho sự phân lập và liệt kê bifidobacteria trong các sản phẩm sữa. Thực phẩm vi sinh Int J, 200128; 69 (3): 167-82.