Agar Müeller Hinton nền tảng, chuẩn bị và sử dụng



các Môi trường Müeller Hinton Nó là một môi trường dinh dưỡng rắn, không chọn lọc, bao gồm truyền thịt, peptone axit casein, tinh bột, agar và nước cất. Phương tiện này cho phép phát triển vi sinh vật tuyệt vời của hầu hết các vi khuẩn phát triển nhanh.

Ban đầu nó được tạo ra bởi John Howard Müeller và Jane Hinton để phân lập vi khuẩn đòi hỏi dinh dưỡng, chẳng hạn như Neisseria gonorrhoeae và Neisseria meningitidis. Tuy nhiên, do đặc điểm của nó, nó trở nên lý tưởng cho nghiên cứu về tính mẫn cảm với kháng sinh, mang lại kết quả đáng tin cậy và có thể tái sản xuất.

Vì lý do này, Müeller Hinton agar là môi trường nuôi cấy được Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và Phòng thí nghiệm (CLSI) và Ủy ban Châu Âu về Thử nghiệm độ nhạy cảm với kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán đĩa Kirby chấp nhận. Bauer.

Chỉ số

  • 1 nền tảng
  • Chuẩn bị 2
  • 3 công dụng
    • 3.1 Kỹ thuật kháng khuẩn
    • 3.2 Vị trí chiến lược của đĩa trên Müeller Hinton agar
  • 4 nguyên nhân dẫn đến kết quả sai
  • 5 giới hạn
  • 6 Kiểm soát chất lượng
  • 7 tài liệu tham khảo

Nền tảng

Bởi vì nó là một môi trường dinh dưỡng không chọn lọc, nó là tuyệt vời cho sự phát triển của hầu hết các vi khuẩn gây bệnh.

Mặt khác, thành phần đơn giản của nó làm cho các chất dễ dàng khuếch tán trên nó, là một đặc tính thiết yếu để kiểm tra độ nhạy bằng phương pháp khuếch tán đĩa..

Một đặc điểm khác của nó là nó chứa một lượng chất ức chế thấp, cho phép đánh giá hiệu quả sulfonamid, trimethoprim và tetracycline..

Tuy nhiên, phải lưu ý rằng phương tiện phải đáp ứng một số điều kiện nhất định để đảm bảo hoạt động đúng, bao gồm:

Điều chỉnh PH, độ sâu agar và nồng độ đầy đủ của thymine, thymidine, Ca++, Mg++ và Zn++.

Chúng ta cũng phải biết rằng phương pháp được chuẩn hóa và do đó tất cả các tham số phải được đáp ứng, chẳng hạn như:

Nồng độ của chủng, nồng độ và bảo quản đĩa kháng sinh, vị trí đặt số lượng đĩa thích hợp trên môi trường thạch, khoảng cách giữa đĩa này và đĩa khác, vị trí chiến lược của một số loại kháng sinh, khí quyển, nhiệt độ và thời gian ủ bệnh.

Chuẩn bị

Cân 37 gr môi trường Müeller Hinton đã khử nước và hòa tan trong 1 lít nước cất. Đun nóng môi trường trong khi khuấy để giúp hòa tan nó. Đun sôi trong 1 phút.

Lấy nồi hấp để khử trùng ở 121 ° C trong 15 phút. Khi lấy ra khỏi nồi hấp, nên đặt fiola trong bể nước ở nhiệt độ 50 ° C để làm mát. Đổ 25 đến 30 ml vào đĩa Petri vô trùng có đường kính 10 cm.

Các tấm phải có độ dày trung bình 4 mm (lý tưởng), với phạm vi cho phép 3-5 mm.

Nếu muốn chuẩn bị thạch máu bằng cách sử dụng cơ sở thạch Müeller Hinton, 5% máu cừu đã được khử trùng và khử trùng được đổ trước khi cho vào đĩa..

Độ pH cuối cùng của môi trường phải nằm trong khoảng từ 7,2 đến 7,4.

Đầu tư và lưu trữ trong tủ lạnh, cho đến khi sử dụng. Cho phép tấm lấy nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

Màu của môi trường chuẩn bị là màu be nhạt.

Công dụng

Nó được sử dụng để thực hiện xét nghiệm độ nhạy cảm với kháng sinh hoặc kháng sinh đối với hầu hết các mầm bệnh không phát triển nhanh.

Nếu agar được bổ sung máu, nó có tác dụng thực hiện kháng sinh đồ của các vi sinh vật đòi hỏi như: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, trong số những người khác. Nó cũng đã được sử dụng để cô lập Legionella pneumophila.

Kỹ thuật kháng sinh

Trước khi thực hiện kháng sinh, phải chuẩn bị dung dịch vi khuẩn tương đương 1,5 x 108 tế bào.

Để làm điều này, 3 đến 4 khuẩn lạc được lấy từ môi trường nuôi cấy tinh khiết và lơ lửng trong nước dùng đậu nành tripticase hoặc trong môi trường Müeller Hinton, ủ trong 2 đến 6 giờ và nồng độ được điều chỉnh bằng nước muối vô trùng, so sánh với tiêu chuẩn Mac Farland. 0,5%.

Nếu chúng đòi hỏi vi sinh vật, các khuẩn lạc có thể bị đình chỉ trực tiếp cho đến khi chúng đạt được nồng độ 0,5% của Mac Farland. Sau đó, tấm Müeller Hinton được gieo bằng tăm bông thấm dung dịch vi khuẩn đã chuẩn bị.

Để làm điều này, nhúng miếng gạc vào dung dịch và sau đó loại bỏ chất lỏng dư thừa bằng cách ấn vào thành ống. Ngay sau khi miếng gạc được truyền qua toàn bộ bề mặt, không để lại các vị trí chưa được xử lý, sau đó xoay nhẹ tấm và gieo lại. Thao tác được lặp lại 2 lần nữa.

Để yên trong 10 phút và sau đó đặt các đĩa kháng sinh bằng một cái kẹp vô trùng, chừa khoảng cách 24 mm giữa chúng. Sau khi đặt từng đĩa lên agar ấn nhẹ từng cái bằng kẹp để đảm bảo rằng chúng được tuân thủ tốt.

Sau quá trình, tấm được đảo ngược và ủ ở 35-37 ° C trong aerobiosis trong 16 đến 18 giờ. Nếu đó là một vi sinh vật đòi hỏi khắt khe, nó có thể yêu cầu vi khuẩn và nếu kháng sinh có chứa đĩa oxacillin thì nên đọc sau 24 giờ.

Một thước đo được sử dụng để đo đường kính của mỗi quầng sáng. Các kết quả phải được ghi lại bằng mm. Sau đó, các giá trị thu được có tương quan với các bảng điểm cắt được công bố bởi hướng dẫn CLSI hiện tại.

Báo cáo là nhạy cảm (S), trung gian (I) hoặc kháng (R), tùy theo từng trường hợp.

Kháng sinh được lựa chọn theo vi sinh vật phân lập và loại nhiễm trùng đang xảy ra.

Đôi khi vị trí chiến lược của kháng sinh nên được xem xét để hiển thị các kiểu kháng thuốc kiểu hình.

Vị trí chiến lược của đĩa trên Müeller Hinton agar

Đối với vi khuẩn enterobacteria, đĩa axit clavulanic phải được đặt trước cephalosporin thế hệ thứ 3 và thứ 4. Việc mở rộng hình quả trứng cho thấy chủng này là nhà sản xuất beta-lactamase phổ mở rộng (ESBL). Điều này có nghĩa là bệnh nhân không nên điều trị bằng bất kỳ cephalosporin nào.

Trong Staphylococcus, điều quan trọng là đặt đĩa erythromycin hoặc azithromycin trước đĩa clindamycin (D-test).

Một quầng kháng trong erythromycin và một quầng trong quầng clindamycin chỉ ra rằng chủng này có khả năng kháng clindamycin, chủng (RIC). Điều này có nghĩa là điều trị bằng clindamycin sẽ không hiệu quả.

Để tìm kiếm các chủng AMP C cảm ứng trong Enterobacteriaceae và một số trực khuẩn Gram âm không lên men, các đĩa ceftazidime, cefoxitin hoặc piperacillin tazobactan phải đối mặt với một đĩa imipenem, ở khoảng cách 27 mm.

Một quầng sáng được làm phẳng ở một trong các đĩa đối diện với imipenem cho thấy sự hiện diện của AMP C cảm ứng.

Để tìm kiếm AMP C cấu thành, một đĩa cloxacillin 500 500g phải đối mặt với ceftazidime (30 g) và với cefotaxime (30 g), ở khoảng cách 25 mm. Một quầng sáng mở rộng ở một trong những cephalosporin cho thấy sự tích cực.

Đĩa cloxacillin cũng có thể được thay thế bằng đĩa 9 mm của giấy lọc Whatman số 6 được tẩm axit phenyl boronic (400 g) với khoảng cách 18 mm. Nó được giải thích giống như trước đây.

Cuối cùng, để điều tra việc sản xuất metallico-beta-lactamase, đặc biệt là trong Pseudomonas aeruginosa, một đĩa được tẩm 10 μl axit ethylenediaminetetraacetic (EDTA 750 g) và axit thioglycolic (SMA 300 g), đối mặt với các đĩa imipenem và meropenem, được sử dụng ở khoảng cách 15 mm.

Thử nghiệm là dương tính nếu có sự mở rộng của halip imipenem hoặc meropenem đối với đĩa EDTA / SMA. Kết quả này phải được xác nhận bằng thử nghiệm Hodge đã sửa đổi.

Phương pháp này bao gồm tiêm chủng Escherichia coli ATCC 25922 trên tấm Müeller Hinton. Một đĩa imipenem được đặt ở trung tâm của đĩa và sau đó một cây sáo được tạo ra từ đĩa về phía ngoại vi với sự căng thẳng của P. aeruginosa nghi ngờ Bạn có thể kiểm tra tối đa 4 chủng trên mỗi đĩa.

Thử nghiệm sẽ dương tính nếu có một vùng biến dạng của quầng imipenem xung quanh địa tầng.

Nguyên nhân của kết quả sai

-Đĩa kháng sinh được bảo quản kém có thể tạo ra điện trở giả. Ví dụ, đĩa oxacillin rất dễ bị thay đổi nhiệt độ.

-Độ pH của môi trường dưới mức chỉ định (axit) tạo ra một nửa nhỏ hơn trong aminoglycoside và macrolide (nguy cơ kháng sai) và một nửa lớn hơn trong penicillin, tetracycline và novobiocin (nguy cơ nhạy cảm sai).

-Nếu độ pH cao hơn chỉ định (kiềm), các hiệu ứng được mô tả ở trên bị đảo ngược.

-Môi trường có nồng độ thymine và thymidine cao ảnh hưởng làm giảm đáng kể các nửa ức chế của sulfonamid và trimethoprim.

-Nồng độ canxi và magiê cao tạo ra tính kháng giả của aminoglycoside, polymyxin B và tetracycline chống lại các chủng Pseudomonas aeruginosa.

-Nồng độ canxi và magiê thấp tạo ra sự nhạy cảm sai lệch của aminoglycoside, polymyxin B và tetracycline chống lại các chủng Pseudomonas aeruginosa.

-Sự hiện diện của kẽm ảnh hưởng đến kết quả của đĩa carbapenems (imipenem, meropenem và ertapenem).

-Độ dày của môi trường dưới 3 mm tạo ra kết quả độ nhạy sai, trong khi độ dày trên 5 sẽ tạo ra điện trở sai.

-Việc huy động các đĩa trong kháng sinh đồ sẽ cho halos bị biến dạng, vì việc thải kháng sinh là ngay lập tức.

- Chế phẩm rất yếu ảnh hưởng đến kết quả, vì sẽ không có sự tăng trưởng đồng đều hoặc hợp lưu trong môi trường thạch, một điều kiện cần thiết để có thể đo các vùng ức chế, ngoài ra thực tế là một nửa có thể cho lớn hơn bình thường.

-Inocula quá tải có thể cho một nửa nhỏ hơn bình thường.

-Không tôn trọng khoảng cách giữa các đĩa làm cho một quầng chồng lên nhau và không thể đọc chính xác.

-Ủ bằng CO2 tăng kích thước halos của đĩa tetracycline và methicillin.

-Ủ ở nhiệt độ dưới 35 ° C tạo ra một nửa lớn hơn.

-Việc bổ sung máu làm giảm kích thước quầng của sulfonamit.

Giới hạn

Độ nhạy của kháng sinh thể hiện trong kháng sinh đồ chống lại vi sinh vật (trong ống nghiệm) không đảm bảo rằng nó sẽ hoạt động in vivo.

Kiểm soát chất lượng

Để biết môi trường có chứa lượng thymine phù hợp hay không, nên tạo một chủng của Enterococcus faecalis ATCC 29212 và kiểm tra độ nhạy cảm với trimethoprim sulfamethoxazole (SXT), nó sẽ cho một quầng sáng bằng hoặc> 20 mm để đạt yêu cầu.

Tài liệu tham khảo

  1. "Agar Müller-Hinton." Wikipedia, bách khoa toàn thư miễn phí. Ngày 16 tháng 11 năm 2018, 12:23 UTC. Ngày 27 tháng 1 năm 2019, 04:22
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Chẩn đoán vi sinh của Bailey & Scott. 12 ed. Biên tập Panamericana S.A. Argentina.
  3. Cona E. Điều kiện để nghiên cứu tính mẫn cảm tốt bằng xét nghiệm khuếch tán agar. Rev Chil truyền nhiễm, 2002; 19 (2): 77-81
  4. Phòng thí nghiệm Difco Francisco Soria Melguizo. Môi trường Müeller Hinton với 5% máu cừu. 2009. Có sẵn tại: http://f-soria.es
  5. Phòng thí nghiệm Ag Mü Müeller Hinton II. 2017. Có sẵn tại: .bd.com
  6. Phòng thí nghiệm Britania. Môi trường thạch Müeller. 2015. Có sẵn tại: britanialab.com
  7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Chẩn đoán vi sinh. Tái bản lần thứ 5 Biên tập Panamericana S.A. Argentina.
  8. Martínez-Rojas D. Betalactamasas type AmpC: Chung và phương pháp phát hiện kiểu hình. Mục sư Sóc. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Có sẵn tại: scielo.org.
  9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Phát hiện kiểu hình của metallicobetactamase trong phân lập lâm sàng Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Có sẵn tại: scielo.org.