Agar nền tảng máu, sử dụng và chuẩn bị



các thạch máu nó là một môi trường rắn phong phú, khác biệt nhưng không chọn lọc. Nó được sử dụng để phục hồi và tăng trưởng của một lượng lớn vi sinh vật từ các mẫu lâm sàng hoặc cấy ghép.

Agar máu cổ điển nên được đưa vào để gieo hạt của hầu hết các mẫu lâm sàng nhận được trong phòng thí nghiệm; ngoại trừ các mẫu phân không hữu ích, trừ khi được chuẩn bị với một số sửa đổi nhất định.

Môi trường nuôi cấy này về cơ bản bao gồm một môi trường thạch cơ bản được làm giàu và 5% máu. Cơ sở của agar có thể thay đổi tùy theo nhu cầu, nhưng chủ yếu sẽ bao gồm pepton, axit amin, vitamin, chiết xuất thịt, natri clorua, agar, trong số những người khác.

Đối với máu, thường phải tiếp xúc với bioterium để lấy máu từ động vật, chẳng hạn như cừu, thỏ hoặc ngựa. Tuy nhiên, điều này không phải lúc nào cũng có thể và đôi khi máu người được sử dụng.

Môi trường thạch máu có thể được chuẩn bị trong phòng thí nghiệm hoặc có thể được mua sẵn sàng cho các công ty dành riêng cho nó. Việc chuẩn bị phương tiện này là một trong những điều tế nhị nhất, bất kỳ sự bất cẩn nào trong quá trình chuẩn bị sẽ dẫn đến một lô bị ô nhiễm.

Đó là lý do tại sao tất cả các biện pháp phòng ngừa có thể nên được thực hiện và cuối cùng, kiểm soát chất lượng nên được thực hiện ở nhiệt độ 37 ° C 1 cho mỗi 100 được chuẩn bị.

Chỉ số

  • 1 nền tảng
  • 2 công dụng
    • 2.1 Lựa chọn nhóm máu
    • 2.2 Lựa chọn loại thạch cơ sở
    • 2.3 Công dụng của agar máu theo môi trường cơ sở được sử dụng để điều chế
  • 3 Chuẩn bị
    • 3.1 Cân và hòa tan
    • 3.2 Khử trùng
    • 3.3 Tổng hợp máu
    • 3.4 Đổ vào đĩa Petri
  • 4 tài liệu tham khảo

Nền tảng

Người ta đã đề cập rằng agar máu có đặc tính là một môi trường phong phú, khác biệt và không chọn lọc. Tầng hầm của mỗi thuộc tính này được giải thích dưới đây.

Agar máu là một môi trường được làm giàu bởi vì nó có phụ gia chính là 5 -10% máu trên cơ sở agar. Cả hai hợp chất chứa nhiều chất dinh dưỡng và tính chất này cho phép hầu hết các vi khuẩn có thể phát triển trong đó.

Sự tăng trưởng đó xảy ra mà không hạn chế; vì lý do này, nó không chọn lọc. Tuy nhiên, nếu các hợp chất được thêm vào môi trường này ngăn cản sự phát triển của một số vi sinh vật và có lợi cho sự phát triển của các vi sinh vật khác, nó trở nên chọn lọc. Đây là trường hợp nếu một số loại kháng sinh hoặc thuốc chống nấm được thêm vào.

Tương tự như vậy, agar máu là một môi trường khác biệt, vì nó cho phép phân biệt 3 loại vi khuẩn: tan máu beta, tan máu alpha và tan máu gamma..

Beta-hemolytics là những chất có khả năng ly giải hoặc phá vỡ hoàn toàn các tế bào hồng cầu, tạo thành một quầng sáng rõ ràng xung quanh các khuẩn lạc, do đó tạo ra ß hoặc β tán huyết - tan máu và các vi sinh vật được gọi là ß-tán huyết.

Ví dụ về vi khuẩn tan máu ß là Streptococcus pyogenes và Streptococcus agalactiae.

Các phân tử alpha là những chất thực hiện tán huyết một phần, trong đó hemoglobin bị oxy hóa thành methemoglobin, tạo ra màu xanh lục xung quanh các khuẩn lạc. Hiện tượng này được gọi là tan máu α hoặc tan máu và vi khuẩn được phân loại là tan máu.

Ví dụ về vi khuẩn tan máu α là Streptococcus pneumoniae và Liên cầu khuẩn của nhóm viridans.

Cuối cùng, có những vi khuẩn được gọi là gamma-tán huyết hoặc không tan máu. Chúng phát triển trên môi trường thạch mà không tạo ra những thay đổi trên nó, một hiệu ứng được gọi là -phololysis và các vi sinh vật là γ -hemolytic.

Ví dụ về vi khuẩn γ -hemolytic: một số chủng Streptococcus thuộc nhóm D (Streptococcus bovis và Enterococcus faecalis).

Công dụng

Môi trường nuôi cấy thạch máu là một trong những môi trường được sử dụng phổ biến nhất trong phòng thí nghiệm vi sinh.

Trong số các vi sinh vật có khả năng phát triển trên môi trường thạch máu là: nghiêm ngặt, vi khuẩn, vi khuẩn kỵ khí, kỵ khí, vi khuẩn hiếu khí gram dương hoặc gram âm, vi khuẩn phát triển nhanh hoặc chậm.

Một số vi khuẩn đang đòi hỏi hoặc gây khó chịu từ quan điểm dinh dưỡng, cũng như nấm và nấm men, cũng phát triển. Tương tự như vậy, rất hữu ích cho việc nuôi cấy hoặc kích hoạt lại các chủng rất yếu về mặt trao đổi chất.

Tuy nhiên, việc lựa chọn nhóm máu và môi trường thạch sẽ thay đổi tùy thuộc vào vi sinh vật có thể nghi ngờ có khả năng phục hồi và việc sử dụng các mảng bám (nuôi cấy hoặc kháng sinh)..

Lựa chọn nhóm máu

Máu có thể là cừu, thỏ, ngựa hoặc người.

Khuyến cáo nhất là máu cừu, với một số ngoại lệ. Ví dụ, để phân lập các loài Haemophilus, trong đó máu được khuyến nghị là ngựa hoặc thỏ, vì máu của cừu có các enzyme ức chế yếu tố V.

Người ít được khuyên dùng nhất là con người, tuy nhiên nó được sử dụng nhiều nhất, có lẽ vì nó dễ kiếm nhất. 

Máu phải được xác định, thu được mà không cần bất kỳ loại phụ gia và từ động vật khỏe mạnh. Đối với việc sử dụng máu người, một số yếu tố phải được lưu ý:

Nếu máu đến từ những người bị nhiễm vi khuẩn, họ sẽ có kháng thể đặc hiệu. Trong những điều kiện này, sự phát triển của một số vi khuẩn có khả năng bị ức chế.

Nếu nó được lấy từ ngân hàng máu, nó có chứa citrate và có thể một số vi khuẩn nhất định không phát triển trong sự hiện diện của nó. Mặt khác, nếu máu đến từ những bệnh nhân đang dùng kháng sinh, sự phát triển của vi khuẩn nhạy cảm có thể bị ức chế.

Và nếu máu là của một người mắc bệnh tiểu đường, lượng glucose dư thừa sẽ cản trở sự phát triển đúng đắn của các mẫu tan máu.

Lựa chọn loại thạch cơ sở

Môi trường thạch được sử dụng để điều chế agar máu có thể rất rộng. Trong số đó là: agar dinh dưỡng, agar truyền dịch não, agar đậu nành trypticase, agar Müeller Hinton, agar Thayer Martin, agar Columbia, agar Brucella, agar Campylobacter, v.v..

Sử dụng agar máu theo môi trường cơ bản được sử dụng để chuẩn bị

Thạch dinh dưỡng

Cơ sở này ít được sử dụng nhất, bởi vì trên đó nó sẽ phát triển chủ yếu là vi khuẩn không đòi hỏi, chẳng hạn như trực khuẩn đường ruột, Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp, trong số những người khác. Không nên phân lập Streptococcus.

Agar Infusion Infar (BHI)

Nó là một trong những chất được sử dụng nhiều nhất làm nền tảng của agar máu, bởi vì nó có các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của hầu hết các vi khuẩn, bao gồm Streptococcus sp và các vi khuẩn đòi hỏi khác. Mặc dù không thích hợp để quan sát các mẫu tan máu.

Máu cừu thường được sử dụng với cơ sở này.

Các biến thể agar máu cũng có thể được chuẩn bị, trong đó các hợp chất khác được thêm vào để phân lập một số vi sinh vật. Ví dụ, agar truyền dịch não bổ sung máu thỏ, cystine và glucose, phục vụ để phân lập Francisella tularensis.

Trong khi đó, với cystine Tellurite rất hữu ích cho việc phân lập Corynebacterium diphteriae. Bạn có thể sử dụng máu người hoặc cừu.

Với lần tan máu beta đầu tiên sẽ trông giống như một quầng sáng hẹp, trong khi với lần thứ hai, quầng sáng sẽ rộng hơn nhiều.

Tương tự, cơ sở này cùng với bacitracin, tinh bột ngô, máu ngựa và các chất bổ sung làm giàu khác (IsoVitaleX), được sử dụng để phân lập chi Haemophilus sp từ mẫu hô hấp.

Ngoài ra, nếu bạn thêm sự kết hợp của kháng sinh chloramphenicol - gentamicin hoặc penicillin - streptomycin với máu ngựa, lý tưởng cho việc phân lập nấm gây bệnh đòi hỏi, thậm chí với năng suất cao hơn so với thạch glucose Sabouraud. Nó đặc biệt hữu ích trong việc cô lập Histoplasma capsulatum.

Đậu tương cố định

Cơ sở này được khuyến nghị nhiều nhất để quan sát tốt hơn về mô hình tán huyết và thực hiện các xét nghiệm chẩn đoán như phân loại optoquine và bacitracin. Đó là agar máu cổ điển được sử dụng thường xuyên.

Với cơ sở này, bạn cũng có thể chuẩn bị thạch máu đặc biệt cho Corynebacterium diphteriae, với cystine Tellurium và máu cừu.

Tương tự như vậy, sự kết hợp của agar này với máu cừu cộng với kanamycin-vancomycin là lý tưởng cho sự phát triển của vi khuẩn kỵ khí, đặc biệt là Vi khuẩn sp.

Agar Müeller Hinton

Cơ sở bổ sung máu này được sử dụng để thực hiện kháng sinh đồ của các vi sinh vật đòi hỏi, chẳng hạn như Streptococcus sp.

Nó cũng hữu ích cho việc phân lập vi khuẩn như Legionella pneumophila.

Agar Thayer Martin

Phương tiện này là lý tưởng làm cơ sở cho agar máu khi nghi ngờ chi Neisseria, đặc biệt là Neisseria meningitidis, kể từ khi Bệnh lậu không phát triển trên môi trường thạch máu.

Nó cũng phục vụ để thực hiện các xét nghiệm độ nhạy cảm để Neisseria meningitidis.

Agar Columbia

Cơ sở này là tuyệt vời cho hạt giống sinh thiết dạ dày để tìm kiếm Vi khuẩn Helicobacter pylori.

Môi trường được điều chế bằng cách thêm 7% máu cừu được khử rung bằng kháng sinh (vancomycin, trimethoprim, amphotericin B và cefsulodin) để hạn chế sự phát triển của các loại vi khuẩn khác có thể có mặt.

Cơ sở tương tự bổ sung máu người hoặc máu cừu, axit nalidixic và colistin rất hữu ích để phân lập Âm đạo giả. Nó cũng lý tưởng để đánh giá tính mẫn cảm với kháng sinh đối với kháng sinh của cùng loại vi sinh vật.

Ngoài ra, nó được sử dụng để điều chế agar máu để nuôi cấy vi khuẩn kị khí, thêm aminoglycoside và vancomycin.

Cơ sở này cho phép chúng ta quan sát đúng các mô hình tán huyết.

Agar Brucella

Môi trường này được sử dụng làm cơ sở của agar máu cùng với việc bổ sung vitamin K là lý tưởng cho việc nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí. Trong trường hợp này, nên sử dụng máu cừu.

Thạch Campylobacter

Campylobacter Agar bổ sung 5% máu cừu và 5 loại kháng sinh (cefalotin, amphotericin B, trimethoprim, polymyxin B và vancomycin), là phương tiện được sử dụng để phân lập Campylobacter jejuni trong mẫu phân.

Chuẩn bị

Mỗi ngôi nhà thương mại mang đến mặt sau của gói hướng dẫn để chuẩn bị một lít môi trường nuôi cấy. Các tính toán tương ứng có thể được thực hiện để chuẩn bị số lượng mong muốn, theo môi trường cơ sở đã chọn.

Cân và hòa tan

Môi trường thạch bị mất nước (dạng bột), do đó nó phải được hòa tan trong nước cất được điều chỉnh đến pH 7.3.

Lượng được chỉ định bởi môi trường thạch đã chọn được cân và hòa tan trong lượng nước tương ứng trong một fiola, sau đó được đun nóng ở nhiệt độ vừa phải và trộn với chuyển động quay cho đến khi tất cả bột được hòa tan..

Khử trùng

Sau khi hòa tan, khử trùng trong nồi hấp ở 121 ° C trong 20 phút.

Tổng hợp máu

Khi rời nồi hấp, hãy để fiola nguội đi cho đến khi nhiệt độ dao động trong khoảng từ 40 đến 50 ° C; là nhiệt độ mà da người hỗ trợ và đồng thời agar vẫn chưa đông cứng.

Đối với điều này, fiola được chạm bằng tay và nếu nhiệt độ có thể chịu được, đó là nhiệt độ lý tưởng để thêm lượng máu được xác định tương ứng (50 ml mỗi lít thạch). Trộn nhẹ nhàng để đồng nhất.

Sự đi qua của tổng hợp máu là rất quan trọng, bởi vì nếu nó được thực hiện khi môi trường rất nóng, các tế bào hồng cầu sẽ bị phá vỡ và môi trường sẽ không phục vụ để quan sát tan máu.

Nếu nó được thêm vào quá lạnh, các cục sẽ hình thành và bề mặt của môi trường sẽ không được mịn để làm cho sáo đúng cách.

Đổ vào đĩa Petri

Phục vụ trong đĩa petri vô trùng ngay sau khi đồng nhất máu. Khoảng 20 ml được đổ vào mỗi đĩa Petri. Quy trình này được thực hiện trong tủ hút dòng chảy hoặc gần bật lửa.

Khi phục vụ agar máu trong các đĩa Petri, không nên có bọt khí trên bề mặt đĩa. Nếu điều này xảy ra, ngọn lửa của đầu đốt Bunsen nhanh chóng được truyền qua tấm để loại bỏ chúng..

Các tấm được phép hóa rắn và bảo quản trong tủ lạnh (2-8 ° C) đảo ngược cho đến khi sử dụng. Trước khi sử dụng các đĩa thạch máu nên được tôi luyện (để chúng lấy nhiệt độ phòng) để được gieo.

Các tấm chuẩn bị kéo dài khoảng 1 tuần.

Tài liệu tham khảo

  1. Bayona M. Điều kiện vi sinh để canh tác Vi khuẩn Helicobacter pylori. Rev Col Gastroenterol 2013; 28 (2): 94-99
  2. García P, Paredes F, Fernández del Barrio M. (1994). Thực hành vi sinh lâm sàng. Đại học Cadiz, tái bản lần thứ 2. Dịch vụ xuất bản UCA.
  3. "Máu máu." Wikipedia, bách khoa toàn thư miễn phí. Ngày 10 tháng 12 năm 2018, 14:55 UTC. Ngày 27 tháng 12 năm 2018, 01: 49 vi.wikipedia.org.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Chẩn đoán vi sinh của Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Panamericana S.A Biên tập.
  5. Trung tâm chẩn đoán thú y phòng thí nghiệm CEDIVET. Guatemala Có sẵn tại: trensa.com.
  6.  Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Chẩn đoán vi sinh. (Tái bản lần thứ 5). Argentina, Biên tập Panamericana S.A..