Giemsa nhuộm nền, vật liệu, kỹ thuật và sử dụng



các Vết bẩn Giemsa là một loại nhuộm màu của các mẫu lâm sàng, dựa trên hỗn hợp axit và thuốc nhuộm cơ bản. Sáng tạo của nó được lấy cảm hứng từ công trình của Romanowsky, nơi mà Christopher Giemsa, nhà hóa học và nhà vi khuẩn học gốc Đức, đã hoàn thiện nó bằng cách thêm glycerol để ổn định các hợp chất.

Những thay đổi được tạo ra cho kỹ thuật ban đầu của Romanowsky cho phép cải thiện đáng kể các quan sát vi mô, do đó kỹ thuật này đã được rửa tội với tên của vết bẩn Giemsa.

Bởi vì nó là một kỹ thuật đơn giản để thực hiện, có tính chức năng và kinh tế cao, hiện đang được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm lâm sàng để làm xét nghiệm huyết học, mẫu tủy xương và các phần mô..

Kỹ thuật nhuộm Giemsa rất hữu ích cho các nghiên cứu tế bào học, vì nó cho phép quan sát các cấu trúc cụ thể của các tế bào. Kỹ thuật này nhuộm các tế bào chất, hạt nhân, hạt nhân, không bào và hạt của các tế bào, có thể phân biệt được cả dấu vết của chất nhiễm sắc.

Ngoài ra, những thay đổi đáng kể về kích thước, hình dạng hoặc màu sắc của hạt nhân có thể được phát hiện, trong đó có thể hình dung sự mất mát của mối quan hệ nhân-tế bào chất.

Mặt khác, nó cho phép xác định các tế bào chưa trưởng thành trong tủy xương và máu ngoại vi, rất quan trọng để chẩn đoán các bệnh nghiêm trọng như bệnh bạch cầu. Cũng có thể phát hiện hemoparaite, vi khuẩn ngoại bào và nội bào, nấm, trong số những người khác.

Trong tế bào học, nó được sử dụng khá nhiều, vì có thể nghiên cứu quá trình nguyên phân của các tế bào.

Chỉ số

  • 1 Nền tảng của màu Giemsa
  • 2 Vật liệu
    • 2.1 Nguyên liệu pha chế dung dịch mẹ
    • 2.2 Chế độ pha chế dung dịch mẹ
    • 2.3 Vật liệu để chuẩn bị dung dịch đệm
    • 2.4 Chuẩn bị cuối cùng của thuốc nhuộm
    • 2.5 Vật liệu bổ sung cần thiết để thực hiện tô màu
  • 3 Kỹ thuật
    • 3.1 Quy trình nhuộm
  • 4 tiện ích
    • 4.1 huyết học
    • 4.2 Mycology
    • 4.3 Vi khuẩn học
    • 4.4 Ký sinh trùng
    • 4.5 Tế bào học
    • 4.6 Tế bào học
  • 5 Nghiên cứu chứng minh tính hiệu quả của nhuộm Giemsa
  • 6 khuyến nghị cho nhuộm tốt
  • 7 lỗi phổ biến trong việc tô màu Giemsa
    • 7.1 Màu xanh cực kỳ
    • 7.2 Màu hồng quá mức
    • 7.3 Sự hiện diện của kết tủa
    • 7.4 Sự hiện diện của các tạo tác hình thái
  • 8 Chế độ lưu trữ
  • 9 Tài liệu tham khảo

Nền tảng của màu Giemsa

Thuốc nhuộm kiểu Romanowsky dựa trên việc sử dụng độ tương phản giữa axit và thuốc nhuộm cơ bản, để đạt được sự nhuộm màu của các cấu trúc cơ bản và axit, tương ứng. Có thể thấy, có một ái lực của thuốc nhuộm axit để nhuộm các cấu trúc cơ bản và ngược lại.

Thuốc nhuộm cơ bản được sử dụng là xanh methylen và các dẫn xuất oxy hóa của nó (Azure A và Azure B), trong khi thuốc nhuộm axit là eosin.

Cấu trúc axit của các tế bào là axit nucleic, hạt của basophils được phân đoạn, trong số các loại khác, do đó chúng sẽ được nhuộm bằng xanh methylen.

Theo nghĩa tương tự, các cấu trúc cơ bản của các tế bào là huyết sắc tố và một số hạt như những hạt có trong bạch cầu ái toan phân đoạn, trong số những loại khác; những thứ này sẽ được nhuộm bằng eosin.

Mặt khác, do thực tế là xanh methylen và xanh dương được đặc trưng bởi thuốc nhuộm metachromatic, chúng có thể cung cấp một tông màu thay đổi cho các cấu trúc khác nhau tùy theo tải trọng của polyanions mà chúng sở hữu..

Đây là cách kết hợp chiến lược của thuốc nhuộm cơ bản và axit có thể phát triển phổ màu rộng, theo đặc điểm sinh hóa của từng cấu trúc, đi qua các tông màu xanh nhạt, xanh đậm, tím và tím trong trường hợp cấu trúc axit.

Trong khi màu được cung cấp bởi eosin ổn định hơn, tạo ra màu giữa cam đỏ và cá hồi.

Vật liệu

Nguyên liệu pha chế dung dịch mẹ

Việc chuẩn bị dung dịch gốc đòi hỏi phải cân 600 mg thuốc nhuộm Giemsa dạng bột, đo 500 cc rượu metylic không chứa acetone và 50 cc glycerin trung tính.

Chế độ pha chế dung dịch mẹ

Đặt bột Giemsa nặng vào cối. Nếu có cục u, chúng nên được phun. Sau đó thêm một lượng đáng kể glycerin đo được và trộn rất tốt. Hỗn hợp thu được được đổ vào một chai hổ phách rất sạch.

Phần còn lại của glycerin được đặt trong vữa. Trộn lại để làm sạch thuốc nhuộm còn lại đã bị dính vào tường của vữa và đổ vào cùng một chai.

Chai được đậy nắp và mang trong 2 giờ trong bể nước ở 55ºC. Trong khi tắm bain-marie, khuấy nhẹ hỗn hợp sau mỗi nửa giờ hoặc lâu hơn.

Sau đó, hỗn hợp được phép làm mát để đặt rượu. Trước đây, một phần của rượu đo được đặt vào cối để rửa xong phần còn lại của thuốc nhuộm và sau đó nó được thêm vào hỗn hợp cùng với phần còn lại của rượu.

Chuẩn bị này nên được cho phép để trưởng thành trong ít nhất 2 tuần. Phần được sử dụng của dung dịch mẹ phải được lọc.

Để tránh ô nhiễm của chế phẩm, nên chuyển phần sẽ được sử dụng liên tục vào một chai hổ phách nhỏ có ống nhỏ giọt. Nạp lại mỗi lần thuốc thử hết.

Nguyên liệu để chuẩn bị dung dịch đệm

Mặt khác, dung dịch đệm ở pH 7.2 được chuẩn bị như sau:

6,77 gam natri photphat (khan) được cân (NaHPO4), 2,59 g kali dihydrogen phosphate (KH)2PO4) và nước cất lên đến 1000 cc.

Chuẩn bị cuối cùng của thuốc nhuộm

Đối với việc chuẩn bị dung dịch nhuộm cuối cùng, 2 cc dung dịch gốc đã lọc được đo và trộn với 6 cc dung dịch đệm. Hỗn hợp được khuấy.

Một thực tế có liên quan phải được tính đến, đó là các kỹ thuật điều chế thuốc nhuộm có thể thay đổi theo nhà thương mại.

Vật liệu bổ sung cần thiết để thực hiện tô màu

Ngoài các vật liệu được mô tả, nó cần được cung cấp cầu màu, màn hình nước hoặc đệm để giặt, tấm cho đồ vật hoặc vỏ, đồng hồ bấm giờ để kiểm soát thời gian tô màu và giấy thấm hoặc một số vật liệu có thể được sử dụng để làm khô ( gạc hoặc bông).

Kỹ thuật

Quá trình nhuộm

1) Trước khi tô màu, bạn phải trải mẫu trên một phiến sạch..

Các mẫu có thể là máu, tủy xương, vết cắt của mô mô học hoặc mẫu cổ tử cung-âm đạo. Chúng tôi đề nghị rằng bên ngoài phải mỏng và có 1 hoặc 2 giờ sấy khô trước khi tô màu chúng.

2) Tất cả các tờ bạn phải tô màu được đặt trên một cây cầu màu. Luôn làm việc theo cùng một thứ tự và xác định rõ từng tờ.

3) Đặt một vài giọt cồn methyl 100% (metanol) lên vết bẩn và để trong 3 đến 5 phút, để cố định và khử nước cho mẫu.

4) Loại bỏ metanol có trong tờ và để khô tự nhiên.

5) Sau khi khô, đặt dung dịch nhuộm cuối cùng bằng ống nhỏ giọt cho đến khi toàn bộ tấm được phủ. Để trong 15 phút. Một số tác giả đề nghị tối đa 25 phút. Phụ thuộc vào nhà thương mại.

6) Xả thuốc nhuộm và rửa vết bẩn bằng nước cất hoặc dung dịch đệm 7.2.

7) Trên một tờ giấy thấm để tờ giấy khô trong không khí mở, được sắp xếp theo chiều dọc với sự trợ giúp của một bộ phận hỗ trợ.

8) Lau sạch mặt sau của phiến bằng gạc hoặc tăm bông được làm ẩm bằng cồn để loại bỏ bất kỳ thuốc nhuộm còn lại.

Tiện ích

Kỹ thuật nhuộm Giemsa được sử dụng trong một số lĩnh vực, bao gồm: huyết học, nấm học, vi khuẩn học, ký sinh trùng, tế bào học và tế bào học.

Huyết học

Đây là tiện ích thường xuyên nhất được cung cấp cho nhuộm này. Với nó, chúng ta có thể xác định từng tế bào có trong các mẫu tủy xương hoặc máu ngoại vi. Cũng như ước tính số lượng của từng loạt, có thể phát hiện giảm bạch cầu hoặc giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu, vv.

Bởi vì nó nhạy cảm để xác định các tế bào chưa trưởng thành, nó có liên quan trong chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp tính hoặc mãn tính. Cũng có thể chẩn đoán thiếu máu, chẳng hạn như bệnh hồng cầu hình liềm, bệnh hồng cầu hình liềm, trong số những người khác..

Bệnh học

Trong lĩnh vực này, người ta thường sử dụng nó để tìm kiếm Histoplasma capsulatum (nấm lưỡng hình nội bào) trong các mẫu mô.

Vi khuẩn học

Trong phết tế bào huyết học nhuộm Giemsa có thể phát hiện Borrelias sp ở những bệnh nhân bị bệnh gọi là sốt tái phát. Spirochetes có nhiều trong số hồng cầu, trong các mẫu được lấy ở đỉnh sốt.

Cũng có thể hình dung vi khuẩn nội bào là Rickettsias sp và Chlamydia trachomatis trong các tế bào bị nhiễm bệnh.

Ký sinh trùng

Trong lĩnh vực ký sinh trùng, nhuộm Giemsa đã cho phép chẩn đoán các bệnh ký sinh trùng như sốt rét, bệnh Chagas và bệnh leishmania..

Trong hai ký sinh trùng đầu tiên Plasmodium sp và Trypanosoma cruzi tương ứng chúng có thể được nhìn thấy trong máu ngoại vi của bệnh nhân bị nhiễm bệnh, chúng có thể được tìm thấy ở các giai đoạn khác nhau tùy theo giai đoạn bệnh.

Để cải thiện việc tìm kiếm ký sinh trùng máu, nên sử dụng vết Giemsa trộn với thuốc nhuộm May-Grünwald.

Tương tự như vậy, bệnh leishmania ở da có thể được chẩn đoán khi đánh giá các mẫu sinh thiết da được nhuộm bằng Giemsa, nơi tìm thấy ký sinh trùng.

Tế bào học

Nhuộm Giemsa cũng được sử dụng cho nghiên cứu tế bào học của các mẫu nội tiết, mặc dù nó không phải là kỹ thuật được sử dụng thường xuyên nhất cho mục đích này.

Nhưng trong trường hợp khan hiếm tài nguyên có thể được sử dụng, có chức năng tương tự như được cung cấp bởi kỹ thuật Papanicolaou và với chi phí thấp hơn. Tuy nhiên, nó đòi hỏi chuyên môn về phía giám khảo.

Tế bào học

Một tính năng có liên quan của nhuộm Giemsa là khả năng liên kết mạnh với các vùng giàu adenines và thymines DNA. Điều này cho phép DNA được hiển thị trong quá trình nguyên phân của các tế bào, trong các trạng thái ngưng tụ khác nhau.

Những nghiên cứu này là cần thiết để phát hiện quang sai màu như trùng lặp, xóa hoặc dịch mã của các vùng khác nhau của nhiễm sắc thể..

Nghiên cứu chứng minh hiệu quả của nhuộm Giemsa

Cannova et al (2016), đã so sánh 3 kỹ thuật tô màu để chẩn đoán bệnh leishmania dưới da.

Đối với điều này, họ đã sử dụng các mẫu thu được từ một động vật thí nghiệm (Mesocrisetus auratus) thí nghiệm cấy với Leishmanias.

Các tác giả đã chứng minh rằng nhuộm Giemsa tốt hơn nhuộm Pap-mart® và Gaffney. Do đó, họ cho rằng vết Giemsa là lý tưởng để chẩn đoán bệnh leishmania dưới da.

Các kết quả tuyệt vời mà các tác giả thu được là do sự kết hợp các thuốc nhuộm tạo nên hỗn hợp Giemsa đưa ra các điều kiện cần thiết để tạo ra sự tương phản thuận lợi, cho phép phân biệt rõ ràng các cấu trúc amastigote, cả bên trong và ngoại bào..

Các kỹ thuật khác (Pap-mart® và Gaffney) cũng đã làm điều đó, nhưng theo cách yếu hơn và do đó khó hình dung hơn. Đó là lý do tại sao vết Giemsa được khuyên dùng để chẩn đoán ký sinh trùng của bệnh leishmania.

Tương tự như vậy, một nghiên cứu của Ramírez et al (1994), đã đánh giá tính hợp lệ của vết bẩn Giemsa và Lendrum trong phết kết mạc để xác định Chlamydia trachomatis.

Các tác giả đã xác định rằng nhuộm Giemsa và Ledrum có cùng độ đặc hiệu, nhưng Giemsa nhạy hơn.

Điều này giải thích tại sao nhuộm Giemsa hiện được sử dụng thường xuyên nhất để chẩn đoán nhiễm chlamydia, đặc biệt là nếu có ít tài nguyên.

Khuyến nghị nhuộm màu tốt

Việc sấy khô các tấm không nên được tăng tốc. Thời gian thận trọng phải được chờ để làm khô nó trong không khí mở. Khoảng 2 giờ.

Tô màu ngay sau 2 giờ để có kết quả tốt nhất.

Để các vết bẩn được cố định và nhuộm màu tốt hơn, mẫu phải được phân phối trên tấm sao cho vẫn giữ được một lớp mỏng và đồng nhất.

Mẫu máu được ưu tiên là mao quản, vì phết tế bào được tạo ra trực tiếp từ giọt máu và do đó mẫu không có phụ gia, giúp duy trì cấu trúc tế bào.

Tuy nhiên, nếu sử dụng máu tĩnh mạch thì nên sử dụng EDTA như một chất chống đông máu chứ không phải heparin, vì sau này thường làm biến dạng các tế bào.

Những lỗi thường gặp trong việc tô màu Giemsa

Trong thực tế của màu này, sai lầm có thể được thực hiện. Chúng được chứng minh bằng những thay đổi đột ngột trong sắc thái của các cấu trúc.

Màu xanh cực kỳ

Nó có thể là do:

  • Vết bẩn rất dày
  • Vượt quá thời gian nhuộm
  • Rửa quá ít.
  • Sử dụng thuốc thử cao hơn pH trung tính (kiềm).

Trong những điều kiện này, màu sắc của các cấu trúc sau bị biến dạng, do đó hồng cầu thay vì chết màu hồng - cá hồi sẽ có màu xanh lục, các hạt của bạch cầu ái toan nên được nhuộm màu đỏ gạch sẽ chuyển sang màu xanh hoặc xám và do đó sẽ có sai lệch trong các âm điệu thông thường.

Quá nhiều màu hồng

Nó có thể là do:

  • Thời gian nhuộm không đủ.
  • Rửa lâu hoặc quá nhiều.
  • Sấy khô.
  • Sử dụng thuốc thử rất axit.

Trong trường hợp cụ thể này, các cấu trúc thường có màu xanh lam sẽ không thể nhìn thấy được, trong khi các cấu trúc được nhuộm màu hồng sẽ có các tông màu rất cường điệu.

Ví dụ: hồng cầu sẽ có màu đỏ tươi hoặc màu cam mạnh, nhiễm sắc thể hạt nhân sẽ có màu hồng nhạt và các hạt của bạch cầu ái toan sẽ có màu đỏ tươi..

Sự hiện diện của kết tủa trong vết bẩn

Các nguyên nhân có thể là:

  • Sử dụng tấm bẩn hoặc giặt kém.
  • Đừng để vết bẩn khô.
  • Để dung dịch sửa chữa quá lâu.
  • Giặt không đầy đủ vào cuối nhuộm.
  • Lọc không đầy đủ hoặc không lọc của thuốc nhuộm đang được sử dụng.

Sự hiện diện của các tạo tác hình thái

Các tạo tác hình thái có thể xuất hiện trong các vết bẩn, gây khó khăn cho việc hình dung và giải thích các cấu trúc hiện tại. Điều này là do:

  • Loại thuốc chống đông máu được sử dụng, chẳng hạn như heparin.
  • Sử dụng tấm bẩn, hư hỏng hoặc dầu mỡ.

Chế độ lưu trữ

Sau khi chuẩn bị thuốc nhuộm nên được giữ ở nhiệt độ phòng (15 - 25 ° C), để tránh thuốc nhuộm kết tủa. Nó phải được lưu trữ trong một thùng chứa hổ phách kín.

Tài liệu tham khảo

  1. Cannova D, Brito E và Simons M. Đánh giá các kỹ thuật tạo màu để chẩn đoán bệnh Leishmania dưới da. Salus.  2016; 20 (2): 24-29.
  2. Thuốc thử PanReac Applichem ITW. Giemsa vết bẩn. Phiên bản 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Tây Ban Nha.
  3. Clark G. Stained thủ tục (1981), thứ 4. Williams & Willkins.
  4. Ứng dụng hóa học lâm sàng Thuốc nhuộm Giemsa để chẩn đoán trong ống nghiệm. Nhà phân phối: cromakit.es
  5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F và Grazioso C. Hiệu lực của vết bẩn Giemsa và Lendrum trong vết bẩn kết mạc để xác định Chlamydia trachomatis. Bol của Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
  6. Casas-Rincon G. Mycology chung. 1994. Ed Ed. Đại học Trung tâm Venezuela, Phiên bản thư viện. Venezuela, Venezuela.
  7. "Giemsa vết." Wikipedia, bách khoa toàn thư miễn phí. Ngày 1 tháng 9 năm 2017, 01:02 UTC. Ngày 6 tháng 12 năm 2018, vi.wikipedia.org.